引用本文
唐天才, 刘城成, 袁东波, 郭莉, 侯巍, 莫茜, 阳爱国, 郝力力, 李锐. 四川石渠县牦牛源蜱感染巴尔通体的分子流行病学调查[J]. 浙江农业学报, 2019,31(7): 1066-1072.
TANG Tiancai, LIU Chengcheng, YUAN Dongbo, GUO Li, HOU Wei, MO Xi, YANG Aiguo, HAO Lili, LI Rui. Molecular detection of Bartonella infection in ixodid ticks collected from yaks in Shiqu County of Sichuan Province [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2019,31(7): 1066-1072.
  
Doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2019.07.05
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四川石渠县牦牛源蜱感染巴尔通体的分子流行病学调查
唐天才1, 刘城成1, 袁东波2, 郭莉2, 侯巍2, 莫茜2, 阳爱国2, 郝力力1,*, 李锐3
1.西南民族大学 生命科学与技术学院,四川 成都 610041
2.四川省动物疫病预防控制中心,四川 成都,610041
3. 浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所,浙江 杭州310021
*通信作者,郝力力,E-mail: leelee_hao@126.com

作者简介:唐天才(1992—),男,四川宜宾人,硕士,主要从事动物寄生虫学研究。E-mail: 495390522@qq.com

收稿日期: 2019-02-07
基金资助: 西南民族大学中央高校基本科研业务费青年教师基金项目(2019NQN48)
摘要

为了解四川省石渠县牦牛体表寄生蜱的种类及其巴尔通体的感染情况。采集牦牛体表的蜱,经形态学初步鉴定后,提取蜱总DNA,PCR扩增蜱细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因和巴尔通体 gltA基因,对阳性产物测序、比对,并构建系统进化树,从而确定蜱及其携带巴尔通体的种类。结果表明:在石渠县4个乡共采集到蜱818只,其中西藏革蜱占78.97%(646/818)、青海血蜱占21.03%(172/818);蜱巴尔通体的总感染率为30.07%,其中阿日扎乡、麻甲乡、德荣玛乡、长须干玛乡蜱巴尔通体的感染率分别为4.76%、76.79%、12.50%、17.95%,麻甲乡西藏革蜱巴尔通体感染率显著高于其他地点( P<0.01),麻甲乡青海血蜱巴尔通体感染率(79.07%)高于西藏革蜱(69.23%),但无显著差异( P>0.05)。经比对分析,总共得到3条序列(uncultured Bartonella sp. shiqu 1,uncultured Bartonella sp. shiqu 2和uncultured Bartonella sp. shiqu 3)。遗传进化分析显示,uncultured Bartonella sp. shiqu 1和uncultured Bartonella sp. shiqu 2与未定种的 Bartonella spp. RF124HAIN (FJ464240)亲缘关系最近;uncultured Bartonella sp. Shiqu 3与对人有致病性的 Bartonella melophagi亲缘关系最近。综上,石渠县存在西藏革蜱和青海血蜱,蜱巴尔通体感染率较高,并且具有感染人的风险。

关键词: 石渠县; 牦牛; 蜱; 巴尔通体
中图分类号:S855.9+9 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)07-1066-07
Molecular detection of Bartonella infection in ixodid ticks collected from yaks in Shiqu County of Sichuan Province
TANG Tiancai1, LIU Chengcheng1, YUAN Dongbo2, GUO Li2, HOU Wei2, MO Xi2, YANG Aiguo2, HAO Lili1,*, LI Rui3
1. College of Life Science & Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China;
2. Center for Animal Disease Control and Prevention in Sichuan Province, Chengdu 610041, China
3. Institute of Quality and Standard for Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
Abstract

In order to investigate tick species and its Bartonella infection from yaks in Shiqu County of Sichuan Province, the ticks collected from yaks were classified by morphological identification. The total DNA of ticks was extracted and partial sequences of COⅠ and gltA gene of ticks and Bartonella were amplified by PCR, respectively. The positive products were sequenced and compared through the NCBI database. Phylogenetic tree was constructed based on COⅠ and gltA for determination species of ticks and Bartonella, respectively. A total of 818 ticks were collected from 4 villages in Shiqu County and only Dermacentor everestianus (78.97%, 646/818) and Haemphysalis qinghaiensis (21.03%, 172/818) were found. The total infection rate of Bartonella in ticks was 30.07% and the infection rates of Arizha, Maga, Derongma and Changxuganma townships were 4.76%, 76.79%, 12.50% and 17.95%, respectively. Compared with other villages, the infection rate of Bartonella in Maga was higher ( P<0.01). In Maga, no significant difference was observed ( P>0.05), though the infection rate of Bartonella in Haemphysalis qinghaiensis(79.07%)was higher than that in Dermacentor everestianus (69.23%). At last, three sequences of gltA were obtained (uncultured Bartonella sp. shiqu 1, uncultured Bartonella sp. shiqu 2 and uncultured Bartonella sp. Shiqu 3). Phylogenetic analysis showed that uncultured Bartonella sp. Shiqu 1 and uncultured Bartonella sp. Shiqu 2 had the closest relationship with the undetermined Bartonella spp. RF124HAIN (FJ464240) and uncultured Bartonella sp. Shiqu 3 had the closest relationship with the human pathogenic Bartonella melophagi. At present, Dermacentor everestianus and Haemphysalis qinghaiensis were found in Shiqu County with high infection of Bartonella, and there existed high risk of human infection.

Keyword: Shiqu County; yak; ticks; Bartonella

巴尔通体(Bartonella)是一类广泛寄生于脊椎动物红细胞内的革兰氏阴性菌, 可引起严重的人兽共患病, 如人类卡里翁病(Carion's disease)、战壕热(trench fever)、猫爪病(cat-sratch disease, CSD)等[1], 是近年来我国新发传染病之一, 具有重要的公共卫生学意义。巴尔通体可广泛存在于自然界的动物体内, 包括犬、猫、兔、牛、鼠, 及一些野生动物等, 并经蜱、蚤、白蛉等吸血节肢动物传播。近年来, 国内外对人、啮齿动物, 以及蜱巴尔通体感染情况进行了相关调查。美国、法国、秘鲁、荷兰采用PCR方法对蜱、蚤体内巴尔通体进行了检测[2, 3]; 意大利、日本、菲律宾等国家对猫巴尔通体感染情况进行了调查[4]; 福建[5]、浙江[6]、黑龙江[7]、云南[8]等省区对蜱、鼠形动物的巴尔通体感染情况进行了一系列调查。石渠县位于四川西北部的纯牧业县, 境内平均海拔4 200 m, 牦牛是当地最重要和数量最多的家畜, 整体养殖方式粗放, 驱虫意识淡薄, 更重要的是牧民与牦牛接触极其紧密, 极易被寄生于牦牛体表的蜱叮咬继而感染相关蜱媒病。到目前为止, 尚无石渠县境内巴尔通体的相关报道。因此, 本研究以石渠县牦牛体表的蜱为研究对象开展调查, 以期初步了解当地牦牛体表寄生蜱的种类及其巴尔通体的感染情况, 为该地区蜱传巴尔通体病的防控提供数据支持。

1 材料与方法
1.1 试验材料

1.1.1 蜱采集

于2018年3至8月从石渠县麻甲乡、德荣马乡、阿日扎乡和长须干玛乡的牦牛体表采集蜱(每个乡选择2~3个村, 每村选择2~3家农户的牦牛群, 每头牦牛体表采集5~6只, 此法采集相对更能保证样本的代表性和真实性), 装入收集管, 塞入潮湿脱脂棉, 形态分类后放入75%乙醇溶液中, 并置于4 ℃冰箱保存待检。

1.1.2 主要试剂

组织基因组DNA提取试剂盒(EasyPure Genomic DNA Kit); Trans 2K Plus DNA marker、2× EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金公司), 1× TAE溶液, 琼脂糖。引物合成、测序均由生工生物工程技术服务有限公司(成都公司)完成。

1.1.3 主要器材

电泳仪电源(北京六一仪器厂, DYY-6C型)、Leica S9D体视显微镜、台式高速离心机(eppendorf 5402型)、Bio-Rad伯乐梯度PCR扩增仪(PTC240型)和Bertin Precellys 24研磨器等。

1.2 方法

1.2.1 蜱形态分类

根据文献[9]和[10], 采用体视显微镜对蜱初步进行形态学鉴定, 鉴定后选取每个地点不同种类蜱的20%进行分子生物学鉴定, 最终确定种类。

1.2.2 DNA提取

取出用75%乙醇保存的样品, 无菌水洗涤晾干后沿纵向中轴线切割, 分别装入EP管, 半只于-80 ℃冰箱冻存, 另外半只加入500 μ L无菌水于Bertin Precellys 24研磨器充分研磨, 参数如下:每管加入陶瓷珠(直径0.5 mm的20珠和2 mm的5珠), 5 500 g研磨2次; 4 000 g研磨1次。取研磨液200 μ L, 用EasyPure Genomic DNA Kit按照说明书提取DNA, 于-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR检测

蜱和巴尔通体的分子鉴定分别采用Ondrejicka等[11]和Reis等[12]建立的方法, 引物见表1。2种引物扩增均采用25 μ L的反应体系:2× Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μ L, 上下游引物各1 μ L(10 μ mol· L-1), 模板1 μ L、ddH2O 9.5 μ L, 混匀。设阳性对照(B. melophagi DNA由本实验室保存)和阴性对照(去离子水)。蜱COⅠ 基因扩增程序为:94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性15 s, 55 ℃退火35 s, 72 ℃延伸55 s, 40个循环; 72 ℃延伸8 min; 16 ℃保温。巴尔通体gltA基因扩增程序为:94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性15 s, 55 ℃退火35 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环; 72 ℃延伸8 min; 16 ℃保温。取2 μ L PCR扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中100 V电泳30 min, 凝胶成像仪中观察结果。

表1 PCR引物 Table 1 PCR primers

1.2.4 序列分析和统计分析

阳性样品送生工生物工程技术服务有限公司(成都公司)测序, 所得序列用DNA Star软件进行拼接分析, 在NCBI中BLAST进行比对, 再应用MEGA 6.0软件以Neighbor-Joining法(bootstrap值1 000)构建系统进化树, 并用SPSS软件对数据进行统计学分析。

2 结果与分析
2.1 蜱采集数量与形态鉴定

4个乡共采集到蜱818只, 分别是长须干玛乡234只、麻甲乡224只、德荣玛乡192只、阿日扎乡168只。经鉴定, 青海血蜱172只, 西藏革蜱646只, 形态特征分别如图1、图2所示。

图1 青海血蜱形态特征
A, 青海血蜱背面; B, 青海血蜱腹面。Fig.1 Morphological characteristics of Haemaphysalis qinghaiensis
 A, Dorsal surface of Haemaphysalis qinghaiensis; B, Ventral surface of Haemaphysalis qinghaiensisi.

图2 西藏革蜱形态特征
A, 西藏革蜱背面; B, 西藏革蜱腹面。Fig.2 Morphological characteristics of Dermacentor everestianus
 A, Dorsal surface of Dermacentor everestianus; B, Ventral surface of Dermacentor everestianus.

2.2 蜱分子鉴定

2.2.1 蜱COⅠ 基因扩增

以提取的蜱组织DNA为模板, 扩增蜱COⅠ 基因片段, 均出现目的条带, 部分样本电泳如图3所示, 片段大小约658 bp, 与预期相符。

图3 麻甲乡部分蜱COⅠ 基因PCR产物电泳图
M, DL 2 000 marker; 1, 阳性对照; 2~8, 蜱样本; 9, 阴性对照。Fig.3 PCR products of COⅠ gene of tick samples
M, DL 2 000 marker; 1, Positive control; 2-8, Tick samples; 9, Negative control.

2.2.2 蜱COⅠ 基因遗传进化分析

蜱COⅠ 基因序列经拼接、比对后共得5条, 其中4条属于西藏革蜱, 1条属于青海血蜱, 分别命名为D. everestianus. shiqu1-4、H. qinghaiensis. shiqu。选取Blast比对后同源性最高的序列1~2条以确定种, 即青海血蜱和西藏革蜱, 再选取不同地点分离到的青海血蜱和西藏革蜱的COⅠ 序列, 最后选取部分不同种类的血蜱和革蜱的COⅠ 序列作为参考序列, 构建进化树。如图4所示, 4个革蜱分离株和西藏革蜱(KJ396938)亲缘关系最近, 同源性达98.0%~99.5%。血蜱分离株则与甘肃天祝(MF981066)、甘肃临洮(MF981034)分离的青海血蜱亲缘关系最近, 同源性达99.09%; 与青海湟源(MF981069)、甘肃永靖(MF982056)分离的青海血蜱同源性分别达98.63%、98.48%。

图4 基于COⅠ 基因蜱种系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic analysis of ticks based on COⅠ gene

2.3 巴尔通体gltA基因PCR扩增

以提取的蜱组织DNA为模板, 扩增巴尔通体gltA基因片段, 麻甲乡部分样本电泳如图5所示, 片段大小约356 bp, 与预期相符。

图5 麻甲乡部分巴尔通体gltA基因PCR产物电泳图
M, DL 2 000 marker; 1, 阳性对照; 2~9, 蜱样本; 10, 阴性对照。Fig.5 PCR products of gltA gene of some samples in Maga village
M, DL 2 000 marker; 1, Positive control; 2-9, Tick samples; 10, Negative control.

2.4 巴尔通体PCR检测结果

巴尔通体检测结果如表2所示, 在818只蜱中, 有246只检测到巴尔通体, 感染率为30.07%(246/818)。其中, 麻甲乡感染率最高, 达76.79%, 其余依次是长须干玛乡17.95%、德荣玛乡12.50%、阿日扎乡4.76%。经χ 2检验, 麻甲乡的感染率显著(P< 0.05)高于其他3个地方。另外, 只在麻甲乡采集到2种蜱。

表2 石渠县蜱巴尔通体PCR检测结果 Table 2 Detection results of ticks-borne Bartonella in Shiqu County
2.5 巴尔通体gltA基因遗传进化分析

巴尔通体gltA基因序列拼接、比对后共得3条, 分别命名为Uncultured Bartonella sp. Shiqu 1-3, 其中Uncultured Bartonella sp. shiqu1与uncultured Bartonella sp.shiqu 2仅1个碱基的差异, 与Uncultured Bartonella sp. shiqu 3有34个碱基的差异。选取Blast比对后同源性最高的序列1~2条, 以及不同种类巴尔通体的gltA基因序列等16条作为参考序列, 构建进化树, 进行种系发育关系分析。如图6所示, Uncultured Bartonella sp. shiqu1和Uncultured Bartonella sp. shiqu 2与美国的Bartonella melophagi(AY724768)序列同源性分别达100%和99.7%, 与我国新疆未定种的Uncultured Bartonella sp.xinjiang (KY224150)同源性分别达100%和99.7%。Uncultured Bartonella sp. shiqu 3与未定种的Bartonella sp. RF124HAIN(FJ464240)序列最接近, 同源性达98%, 与台湾分离的Bartonella grahamii(GU056195)同源性达95%。

图6 基于gltA基因巴尔通体系统进化树分析Fig.6 Phylogenetic tree of Bartonella based on the gltA gene

3 讨论

蜱的发育过程分卵、幼蜱、若蜱、成蜱4个时期, 属不完全变态发育, 在每个时期形态特征不同, 而相近物种之间形态特征又相似, 所以仅从形态学鉴定需要丰富的经验, 难度较大。目前, COⅠ 基因是DNA条形码基因之一, 能够在种的水平对物种进行鉴定 [11, 13]。因此, 形态学与分子生物学相结合的方法已广泛应用于蜱的鉴定, 如Casati等[14]通过COⅠ 基因鉴别了澳大利亚的具角硬蜱与全环硬蜱, 吕继洲等[15]通过COⅠ 基因鉴定了新疆的草原革蜱和边缘革蜱。本研究鉴定出2种蜱, 即青海血蜱和西藏革蜱, 这可能与采集方法和宿主有关, 原因包括:1)蜱生活史中90%以上处于非寄生阶段, 多栖息于草原、森林等生境; 2)单宿主蜱发育阶段均在一个宿主体表, 如微小牛蜱; 3)二宿主和三宿主蜱每一发育阶段饱血后均脱落, 下一阶段重新寻找宿主[16], 如青海血蜱、西藏革蜱。本试验仅从牦牛体表采集, 后期可采用布旗法或者加大宿主种类, 从马、高原鼠兔、高原鼢鼠等体表采集, 从而更系统、更全面、更深入的研究石渠县蜱的种类和分布。此外, 青海血蜱只在麻甲乡采集到, 这可能与蜱的生活特性、海拔有关。每种蜱都有特定的生存环境, 包括海拔、植被类型等, 如西藏革蜱仅生存于3 500~4 500 m的高海拔地区, 而青海血蜱分布在海拔2 000~4 200 m的地区[16]。就地理位置而言, 麻甲乡位于金沙江河谷寒温带半农牧区, 海拔在3 300~3 800 m, 而其他3个乡位于雅砻江流域亚寒带纯牧区, 海拔在4 300~4 600 m, 两区的海拔高度存在明显的差异, 这很可能是只在麻甲乡发现青海血蜱的主要原因。

巴尔通体是一种地理分布广泛, 宿主动物种类繁多, 可通过蜱、蚤等节肢动物传播的人兽共患病原体。gltA基因为巴尔通体的遗传学分类标志[6], 在国内外已被广泛应用于巴尔通体的诊断和研究。如美国[2]、荷兰[3]等均有报道从太平洋硬蜱(Ixodes pacificus)和篦子硬蜱(Ixodes ricinus)等蜱中扩增出巴尔通体的gltA基因, 其感染率分别为19.2%(29/151)和60.0%(73/121); 孙继民等[6]从浙江省中华硬蜱中扩增出巴尔通体的gltA基因, 其感染率为16.3%(14/86)。本试验共采集到818只蜱, 其中有246只检测到巴尔通体, 感染率为30.07%。值得注意的是, 只有在麻甲乡采集到2种蜱, 且青海血蜱的感染率(79.07%)高于西藏革蜱(69.23%), 其主要原因可能是蜱的种类不同。据报道, 某些蜱是一些特定病原的携带者, 如青海血蜱是羊泰勒虫的主要传播媒介[17]; 网纹革蜱(D. reticulatus)更容易携带劳氏立克次体, 而边缘革蜱(D. marginatus)更容易感染斯洛伐克立克次体[18]。本试验中, 相对于西藏革蜱而言, 青海血蜱是否为携带巴尔通体的优势蜱还需进一步研究。另外, 不同地点的感染率存在差异(P< 0.05), 其中, 麻甲乡的总感染率为76.79%, 显著高于其他3个地方, 这可能与麻甲乡相对较低的海拔和舒适的气候有关。

至今证实有B. grahamii、B. melophagi、B. henselae、B. elizabethae等15种巴尔通体可导致人类疾病[19]。有报道从人的血液中通过PCR方法检测到B. melophagi[20], 同样也从以色列的牛血中检测到B. melophagi[21]。鉴于此, 后期可扩大调查对象, 对牦牛血进行检测, 从而深入了解石渠县巴尔通体的流行情况。遗传进化分析显示, 本试验中共检测到2种巴尔通体, 一种与B. melophagi亲缘关系最近, 另一种则与未定种的Bartonella spp. RF124HAIN和B. grahamii遗传关系最接近。

综上所述, 本试验首次对石渠县牦牛源蜱中巴尔通体的感染情况进行了调查, 蜱较高的感染率提示当地居民存在感染巴尔通体的风险, 后期应进一步加强巴尔通体流行情况的监测, 为当地巴尔通体的研究和防控提供数据支持。

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