引用本文
张浩杰, 刘梅, 李春燕, 何冉, 兰景超, 罗娌, 古小彬, 谢跃, 杨光友. 犬恶丝虫核苷二磷酸激酶( NDPK)基因的原核表达及其免疫荧光定位 [J]. 浙江农业学报, 2019,31(9): 1453-1460.
ZHANG Haojie, LIU Mei, LI Chunyan, HE Ran, LAN Jingchao, LUO Li, GU Xiaobin, XIE Yue, YANG Guangyou. Prokaryotic expression and immunofluorescence localization of nucleoside diphosphate kinase gene from Dirofilaria immitis [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2019,31(9): 1453-1460.
  
Doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2019.09.08
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犬恶丝虫核苷二磷酸激酶( NDPK)基因的原核表达及其免疫荧光定位
张浩杰1, 刘梅1, 李春燕1, 何冉1, 兰景超2, 罗娌2, 古小彬1, 谢跃1, 杨光友1,*
1.四川农业大学 动物医学院,四川 成都 611130
2.成都大熊猫繁育研究基地,四川 成都 610081
*通信作者,杨光友,E-mail: guangyou1963@aliyun.com

作者简介:张浩杰(1993—),男,四川眉山人,硕士研究生,主要从事动物寄生虫病学研究。E-mail: jazzachieve@outlook.com

收稿日期: 2019-03-14
基金资助: 成都大熊猫繁育研究基金(CPF2014-09)
摘要

对犬恶丝虫核苷二磷酸激酶( NDPK)基因的基本特征进行探究,并评估其诊断价值,旨在为犬恶丝虫病的诊断提供依据。本研究原核表达了Di-NDPK,通过生物信息学、免疫印迹和免疫荧光组化分析了该蛋白的基本特征,通过检测犬恶丝虫阳性血清评估了rDi-NDPK的诊断价值。免疫印迹显示,Di-NDPK具有良好的反应原性,免疫荧光组化显示,Di-NDPK在犬恶丝虫的侧索及肠上皮细胞和肠腔中分布。间接ELISA显示,该方法的敏感性为66.7%(16/24),特异性为38.9%(14/36),其中与犬细粒棘球蚴病阳性血清、犬钩虫病阳性血清以及犬弓首蛔虫病阳性血清发生交叉反应。Di-NDPK是一个分泌蛋白,但不适合作为犬恶丝虫病的诊断候选抗原。

关键词: 犬恶丝虫; NDPK基因; 克隆; 原核表达; 免疫荧光定位
中图分类号:S855.99 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2019)09-1453-08
Prokaryotic expression and immunofluorescence localization of nucleoside diphosphate kinase gene from Dirofilaria immitis
ZHANG Haojie1, LIU Mei1, LI Chunyan1, HE Ran1, LAN Jingchao2, LUO Li2, GU Xiaobin1, XIE Yue1, YANG Guangyou1,*
1. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
2. Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding, Chengdu 610081, China
Abstract

In order to provide base of heartworm diagnose, this study analyzed the molecular characteristics and identified the diagnostic potential of Dirofilaria immitis nucleoside diphosphate kinase ( NDPK) gene. Di-NDPK was cloned and expressed, and the protein was analyzed by bioinformatic characterization, Western blotting and immunohistochemical analysis. Also the diagnostic potential of rDi-NDPK was evaluated by indirect ELISA. The results of Western blotting indicated that Di-NDPK had good reactivity. Immunohistochemical analysis results showed that Di-NDPK was distributed in hypodermis and intestinal epithelial cells of D.immitis. The indirect ELISA results showed that the sensitivity and specificity were 66.7% (16/24) and 38.9% (14/36) respectively. The cross reactions were observed with serum samples positive for Echinococcus granulosus, Ancylostoma caninum and Ascaris alata. In conclusion, Di-NDPK might be a candidate vaccine antigen, but not a suitable antigen for the detection of D. immitis.

Keyword: Dirofilaria immitis; nucleoside diphosphate kinase gene; clone; prokaryotic expression; immunohistochemical analysis

犬恶丝虫病是由犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)引起的人兽共患寄生虫病, 其成虫主要寄生于犬科和猫科动物的右心室及肺动脉内[1, 2]。该病呈世界性分布, 在热带、亚热带地区广泛流行, 主要通过蚊媒传播, 危害的宿主动物达30余种[1, 2]。人可因被携带犬恶丝虫病原的蚊虫叮咬而感染, 主要引起肺部出现病变, 其次虫体在皮下、眼部、阴囊等处也有发现[3]。近年来, 人感染该病的确诊例数呈逐年上升的趋势, 已引起国际社会的高度重视[4]。目前, 该病的诊断主要通过常规方法检测微丝蚴, 但其灵敏度低, 而免疫学诊断方法尚不完善; 在预防中, 由于尚无商业化的疫苗, 目前主要采用药物预防, 但化学药物存在耐药性及环境污染等问题[2]。

核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase, NDPK, EC 2.7.4.6)是一种“ 管家酶” , 其主要功能是催化腺苷三磷酸(nucleoside triphosphate, ATP)和核苷二磷酸(nucleoside diphosphate, NDP)之间的磷酸基团的转移反应以此来维持细胞NDP和NTP代谢平衡, 对生物体的新陈代谢具有重要意义[5, 6]。近年来研究发现, NDPK还可参与细胞内信号传导, 调节细胞增殖、分化、发育和凋亡等[5, 7, 8]。NDPK已于多种寄生虫中被发现, 如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、硕大利什曼原虫(Leishmania major)、亚马孙利什曼原虫(Leishmania amazonensis)、马来丝虫(Brugia malayi)、旋毛虫(Trichinella spiralis)和捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22], 且认为NDPK可能是潜在的诊断抗原[11, 14, 22]和成为研发新的抗寄生虫药物的靶点[8, 9, 13, 19]。但目前尚未见有关犬恶丝虫NDPK(Di-NDPK)的报道。

本研究从犬恶丝虫成虫转录组数据库中筛选Di-NDPK基因[1], 完成克隆和原核表达, 并分析其基本特征。对NDPK重组蛋白(rDi-NDPK)的反应原性进行了免疫印迹分析; 用免疫组化的方法分析了Di-NDPK在犬恶丝虫雌虫和雄虫体内的分布情况, 为Di-NDPK的功能研究、免疫诊断方法、疫苗和治疗药物等的研发奠定基础。

1 材料与方法
1.1 实验材料

1.1.1 实验样品和试验动物

犬恶丝虫的雌雄虫体均来源于自然感染犬恶丝虫死亡后的犬, 解剖后采集的活虫用PBS清洗, 进行形态学鉴定后储存于液氮中。将犬恶丝虫雌虫和雄虫包埋后, 制作石蜡切片。2只健康新西兰大白兔, 雌性, 1.5~2.0 kg, 购自成都达硕实验动物有限公司。

1.1.2 主要试剂

DH5α 、BL21(DE3)、pMD19-T Vector购于TaKaRa公司; 总RNA抽提试剂盒、TaqPCR MasterMix、质粒小量抽提试剂盒、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购于北京天根生化科技有限公司; DNA Marker、Protein Marker、QuickCutTM限制性内切酶(EcoRⅠ /HindⅢ )、T4 DNA连接酶购于大连宝生物工程有限公司; HRP-标记羊抗兔IgG、HRP-标记兔抗犬IgG购于武汉博士德生物工程有限公司; 琼脂糖凝胶回收试剂盒、镍螯合亲和层析柱、IgG纯化预装柱购于德国Qiagen公司; 反转录试剂盒购于美国Thermo公司; IPTG、弗氏完全佐剂和不完全佐剂购于美国Sigma公司; FITC-标记羊抗兔IgG购于美国EarthOx公司; 其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

从犬恶丝虫成虫转录组数据库中筛选得到的Di-NDPK unigene 8 687(GenBank No.:JR904615.1), ORF Finder工具分析Di-NDPK基因ORF框。利用BLAST对测序得到的目的片段序列进行检索, 确认扩增得到的是NDPK基因。将该基因序列通过Clustal W软件与其他已报道的NDPK基因比对, 用MEGA 5.1软件分别进行序列相似性分析和构建NJ(neighbor-joining)树。

1.2.2 Di-NDPK基因的扩增、克隆

根据GenBank中筛选的序列(GenBank No.:JR904615.1), 用Primer premiere 5.0进行引物的设计, 上游引物:F, 5'-CCG$\underline{GAATTC}$ATGTCAGCTACAAAGGAACGAACATTTA-3'; 下游引物:R, 5'-CCC$\underline{AAGCTT}$CTATTCATACACCCAAGTAATTGTTGCTG-3'(下划线序列分别含EcoRⅠ 和HindⅢ 酶切位点), 采用RT-PCR方法从犬恶丝虫总RNA中扩增Di-NDPK基因的ORF框。按照RNA抽提试剂盒指示提取犬恶丝虫总RNA, 按反转录试剂盒合成cDNA, 再进行PCR扩增。PCR反应体系(10 μ L):预染PCR Mixture 5 μ L, 灭菌水3.5 μ L, 上下游引物及cDNA各0.5 μ L。反应条件:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 45 s, 58.5 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 35个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖核酸凝胶电泳检测是否有目的片段大小的条带, 接着用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的产物, 构建pMD19-T-NDPK及pET-32a-NDPK重组质粒, 将菌液PCR和双酶切鉴定为阳性的重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3 rDi-NDPK的表达和纯化

将测序正确的菌接种于LB液体培养基中(含AMP), 37 ℃环境下培养, 至菌液在紫外分光光度计下D值达0.6左右, 加入IPTG至终浓度为1 mmol· L-1, 继续诱导培养6 h后, 12 000 r· min-1离心收集菌体, 经12%SDS-PAGE电泳检测, 确定rDi-NDPK是否表达, 并同时优化rDi-NDPK基因的原核表达条件。rDi-NDPK在最佳表达条件下大量表达后, 经过镍螯合亲和层析纯化蛋白, 最后用NanoDropTM One超微量紫外分光光度计测定纯化后蛋白的浓度。

1.2.4 rDi-NDPK的Western blotting分析

rDi-NDPK经12%SDS-PAGE分离, 通过半干式转移到硝酸纤维素膜上, 用脱脂奶粉(5%)室温封闭2 h后, 加入一抗(犬恶丝虫阳性血清, 1:100), 在4 ℃条件下孵育过夜; 经TBST洗涤4次后, 加入二抗(HRP-标记兔抗犬IgG, 1:2 000)室温孵育2 h, 再用TBST洗涤4次, 经二氨基联苯胺(DAB)显色后, 超纯水终止反应。

1.2.5 间接免疫荧光染色

用4%多聚甲醛固定犬恶丝虫雄虫和雌虫成虫, 接着用石蜡包埋后制成切片(每片4 μ m), 37 ℃晾干后, 4 ℃保存。试验前, 于60 ℃环境下烘1.0~1.5 h, 再依次按二甲苯Ⅰ (7 min)、二甲苯Ⅱ (7 min)、100%乙醇Ⅰ (3 min)、100%乙醇Ⅱ (3 min)、95%乙醇(3 min)、85%乙醇(3 min)、75%乙醇(3 min)、双蒸水(8 min)进行脱蜡和水化。于95~100 ℃柠檬酸缓冲液中进行抗原的热修复后, 用PBS洗涤3次; 于组织上滴加3%H2O2进行抗原氧化(20 min), 用PBS洗涤3次; 于组织上滴加5%BSA进行封闭(60 min), 用PBS洗涤3次; 于组织上滴加兔NDPK-IgG(1:100), 湿盒中4 ℃孵育过夜; 用PBS洗涤3次, 滴加FITC标记的羊抗兔IgG(0.1%伊文氏蓝1:100稀释), 湿盒中37 ℃避光孵育1 h后使用PBS洗涤3次, 再滴加适量甘油缓冲液封片, 并在荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.2.6 间接ELISA的建立和评估

通过标准棋盘滴定法测定rDi-NDPK与血清反应的ELISA最佳稀释浓度。96孔板中包被抗原浓度10 μ g· 孔-1, 4 ℃过夜。用PBST反复洗涤3次, 加入5%的脱脂奶粉, 37 ℃封闭1.5 h后反复洗涤3次。分别加入犬阳性血清和犬阴性血清, 37 ℃孵育1 h后反复洗涤3次。随后加入HRP标记的羊抗犬二抗孵育1 h。反复洗涤后, 每孔加入100 μ L可溶性TMB显色底物进行显色, 并以2 mol· L-1的H2SO4终止显色, 于酶标仪上测定吸光值(λ =450 nm)。测定24份犬恶丝虫病阴性血清的D450, 按照计算方法, 临界值=平均值+3SD。

用建立的ELISA方法分别对8份细粒棘球蚴病阳性血清, 2份细颈囊尾蚴病阳性血清, 8份犬钩虫病阳性血清, 18份犬弓首蛔虫病阳性血清进行检测, 检测其交叉反应性。

以rDi-NDPK建立的ELISA方法, 对24份犬恶丝虫病阳性血清进行检测, 结合临界值, 判定该方法的可靠性。特异性=真阴性血清数/(真阴性血清数+假阳性血清数)× 100%, 敏感性=真阳性血清数/(真阳性血清数+假阴性血清数)× 100%, 总体符合率=(真阳性血清数+真阴性血清数)/(真阳性血清数+假阳性血清数+真阴性血清数+假阴性血清数)× 100%。检测所有血清的批间变异和批内变异的变异系数(CV), 即标准方差与平均值之比。每个被检测样品在不同的96孔板上分别检测3次, 计算批间CV, 在每个板内设3个重复, 计算批内CV。

2 结果与分析
2.1 Di-NDPK基因的生物信息学分析

2.1.1 Di-NDPK蛋白的理化性质预测

经ORF Finder工具分析预测, Di-NDPK的ORF框长为462 bp, 其中A、T、C、G含量分别为33.77%、27.27%、16.45%、22.51%, G+C含量为38.96%, A+T含量为61.04%。Protparam分析结果显示, Di-NDPK基因序列编码153个氨基酸, 蛋白质的分子式C782H1232N212O221S9, 相对分子量约45.7 ku。蛋白质不稳定系数及亲水性平均数分别为35.94和-0.277, 因此, 预测Di-NDPK是稳定的可溶性蛋白。对Di-NDPK的信号肽切割位点和跨膜区进行预测, 结果显示无信号肽和跨膜区。预测Di-NDPK的B抗原表位结果显示, Di-NDPK的抗原表位主要集中在1-4、91-93、96-106、110-112、122-127位氨基酸。Predictprotein预测Di-NDPK蛋白的二级结构显示, 该蛋白中α -螺旋(H)占39.87%, β -折叠(E)占18.30%, 环状结构(L)占41.83%。

2.1.2 Di-NDPK蛋白的氨基酸序列相似性分析及系统发育树构建

对Di-NDPK基因的氨基酸序列在NCBI中通过BlastP在线搜索, 并通过DNAMAN进行序列比对, 比对结果如图1, 结果发现, Di-NDPK氨基酸序列与罗阿丝虫(Loa loa)(登录号:XP_003139722)、马来丝虫(登录号:P48817)、犬弓首蛔虫(Toxocara canis)(登录号:KHN88613)、有齿食道口线虫(Oesophagostomum dentatum)(登录号:KHJ94439)、鼠类圆线虫(Strongyloides ratti)(登录号:CEF65937)、美洲板口线虫(Necator americanus)(登录号:ETN73053)、十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenale)(登录号:KIH60906)、锡兰钩口线虫(Ancylostoma ceylanicum)(登录号:EPB68610)的NDPK或NDPKa氨基酸序列相似性分别为92%、88%、82%、72%、71%、70%、71%、71%, 且从图中可以看出这些物种有94个氨基酸较为保守。运用MEGA5.0软件构建NJ系统发育树(图2), 从树中可以看出, Di-NDPK与罗阿丝虫和马来丝虫的亲缘关系较近, 聚为一个分支。

图1 犬恶丝虫和其他物种的NDPK多序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment of NDPK in D. immitis and other species

图2 NDPK蛋白的系统发育树(NJ树)Fig.2 Phylogenetic analysis of NDPK proteins (NJ tree)

2.2 Di-NDPK基因的RT-PCR扩增及表达载体的构建

Di-NDPK基因的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳, 得到与预期结果一致的特异性条带(图3-A)。重组质粒pMD19-T-NDPK和pET32a(+)-NDPK经EcoRⅠ 和HindⅢ Quick Cut酶进行双酶切鉴定, 插入片段的大小与预期结果一致 (图3-B、C)。酶切鉴定正确的质粒pET32a(+)-NDPK送去测序, 测序正确的序列用于转入BL21(DE3)菌株中, 进行诱导表达。

图3 Di-NDPK基因的RT-PCR产物及重组质粒的酶切鉴定
M1和M2, DNA分子质量标准; A, Di-NDPK的PCR产物; B, pMD19-T-NDPK的双酶切鉴定; C, pET32a(+)-NDPK的双酶切鉴定。Fig.3 PCR products of Di-NDPK gene and plasmid by restriction endonucleases digestion
M1, DL2000; M2, DL7000; A, PCR products of Di-NDPK; B, Identification of recombinant plasmid pMD19-T-NDPK by restriction endonucleases digestion; C, Identification of recombinant plasmid pET32a(+)-NDPK by restriction endonucleases digestion.

2.3 rDi-NDPK的表达、纯化及免疫印迹

经过条件优化显示, 温度37 ℃, 时间6 h, IPTG浓度为1.0 mmol· L-1是rDi-NDPK原核表达的最佳条件。rDi-NDPK经12%SDS-PAGE电泳, 得到约35 ku的蛋白, 与预期条带大小相同(图4-A)。原核表达的重组菌, 超声破碎后经可溶性分析, 该蛋白以上清的形式存在。经镍柱亲和层析柱纯化后的rDi-NDPK条带单一, 显示纯度较好(图4-B)。免疫印迹分析, 显示rDi-NDPK能与自然感染犬恶丝虫的犬阳性血清特异性结合, 证明rDi-NDPK具有良好的反应原性(图4-B)。

图4 rDi-NDPK的表达、纯化及免疫印迹分析
M, 蛋白质分子质量标准; A, rDi-NDPK蛋白的表达, 1, 经IPTG诱导的含有pET32a(+)-NDPK的细菌; 2、3, 未经IPTG诱导的含有pET32a(+)-NDPK的细菌; 4, 经IPTG诱导的含有pET32a(+)的细菌。B, rDi-NDPK蛋白的纯化及免疫印迹, 1, 纯化后的rDi-NDPK; 2, rDi-NDPK的免疫印迹。Fig.4 The expression and purification of recombinant protein NDPK and Western blotting analysis
M, Protein marker; A, The expression of rDi-NDPK, 1, pET32a(+)-NDPK induced by IPTG; 2, 3, pET32a(+)-NDPK without IPTG induction; 4, pET32a(+) induced by IPTG; B, Purification of rDi-NDPK and Western blotting analysis, 1, Purified rDi-NDPK; 2, Western blotting analysis of rDi-NDPK.

2.4 Di-NDPK的免疫荧光定位

间接免疫荧光显示, Di-NDPK主要分布于雌性犬恶丝虫成虫的肠上皮细胞和肠腔, 尤其在肠上皮细胞中大量分布, 且分泌至肠腔中, 在侧索有少量分布(图5-A、B)。Di-NDPK在雄性犬恶丝虫成虫的侧索、肌肉细胞和肠腔均广泛分布(图5-C、D)。

图5 雌性犬恶丝虫成虫横切面Di-NDPK蛋白的间接免疫荧光定位
A, 雌虫阳性; B, 雌虫阴性对照; C, 雄虫阳性; D, 雄虫阴性对照; HY, 侧索; I, 肠; TE, 睾丸; PS, 假体腔; MU, 肌肉; UT, 子宫; DE, 胚胎。Fig.5 Tissue localization of adult female and male D. immitis NDPK protein detected by indirect immunofluorescence
A, Female positive; B, Female negative control; C, Female positive; D, Female negative control; I, Intestines; PS, Pseudocoelom; UT, Uterus; MU, Muscle; HY, Hypodermis.

2.5 ELISA

间接ELISA结果显示, 最佳血清稀释度为1:20, 最佳抗原包被浓度为0.58 μ g· 孔-1。在最佳血清稀释度和抗原包被浓度条件下, 临界值为0.498。用建立的间接ELISA方法检测24份犬恶丝虫阳性血清, 结果显示, 16份阳性血清D值> 临界值, 8份阳性血清D值< 临界值, 敏感性为66.7%(图6-A)。但与犬细粒棘球蚴病阳性血清、犬钩虫病阳性血清以及犬弓首蛔虫病阳性血清发生交叉反应, 特异性为38.9%(图6-B)。批内重复性试验结果显示, 批内平均变异系数为1.5%, 批间重复性试验结果显示, 批间平均变异系数为6.9%。批内和批间变异系数均小于10%, 证明该方法具有良好的重复性。

图6 重组Di-NDPK间接ELISA分析
A, ELISA临床试验分析; B, ELISA交叉反应试验分析。实线代表cut-off值0.498。Fig.6 Indirect ELISA using rDi-NDPK as the antigen
A, Clinical trial of the iELISA; B, The cross-reaction of the iELISA. The bold horizontal line indicates the cut-off value, which was 0.498.

3 讨论

NDPK存在于多种生物物种, 在进化过程中高度保守[7, 18]。Di-NDPK的氨基酸序列与罗阿丝虫等不同线虫物种的NDPK氨基酸序列相似性高达70%以上。同时, 对Di-NDPK蛋白的二级结构预测发现, 该蛋白含有一个细胞黏附序列, 即RGD序列(aa106-108), 氨基酸相似性比较分析发现, 该序列与其他寄生虫的氨基酸序列完全一致。此外, Di-NDPK蛋白还存在一个核苷二磷酸激酶活性位点(aa116-124), 仅与马来丝虫的同源氨基酸序列位点有1个氨基酸差异, 与普遍公认的NDP磷酸化序列(HGSDSV)也非常一致。其次, RGD序列紧密靠近NDPK活性位点, 有可能RGD序列的Arg(R)残基在底物结合到活性位点裂口的位置中扮演着重要作用。Di-NDPK的C-端残基是YE, 几种线虫的氨基酸相似性分析发现, 这几种线虫的C-端残基也都是YE, 非常保守, 与大多数的NDPK以Y、YE、YET残基结尾较一致, 与报道的恶性疟原虫的C-端残基ICS不同, 这些残基对于NDPK的二聚是非常重要的[5, 8]。此外, 由于Di-NDPK氨基酸序列中存在Lys12, 与人类的Lys12一致, 所以Di-NDPK可能有与DNA结合的活性[5]。

免疫印迹分析发现, rDi-NDPK能够被自然感染犬恶丝虫的犬阳性血清所识别, 提示阳性血清中具有同Di-NDPK特异性结合的抗体, 同时说明rDi-NDPK具有良好的反应原性。在对马来丝虫NDPK研究中也发现, 人携带马来丝虫的慢性无症状的患者血清中NDPK特殊的IgG能被检测出[8]。其次, NDPK在利什曼原虫、旋毛虫和捻转血矛线虫中已被确认存在其分泌蛋白产物中[11, 14, 16, 22]。作为分泌蛋白, 通常暴露在宿主的免疫系统下, 具有潜在的免疫学诊断价值。

犬恶丝虫病的常规诊断方法主要有病原检测, 血清学检测和分子生物学检测[23]。目前, 血清学检测是最常用的检测方法, 分为抗原检测和抗体检测。抗原检测的假阴性结果常见于轻微感染、雌虫尚未成熟、仅感染雄虫等情况; 抗体检测较抗原检测的优势在于, 不论雌虫还是雄虫都能检测出来。宿主感染犬恶丝虫2个月后, 幼虫刺激机体所产生的免疫反应就能被检测出来, 抗体检测比抗原检测能更早地检测出犬恶丝虫, 适用于犬恶丝虫病的早期检测[24]。目前, 已报道的重组抗原DGK、MTFP具有较高的敏感性和特异性, 适合用于犬恶丝虫病的诊断, 同时, 一些敏感性和特异性低的重组抗原, 不适合作为诊断抗原[25, 26]。本实验结果显示, rDi-NDPK敏感性为66.7%, 特异性为38.9%, 同时与犬细粒棘球蚴病血清、犬细颈囊尾蚴病血清、犬钩虫病血清和犬弓首蛔虫病血清的交叉反应。因此, rDi-NDPK蛋白不适合用于犬恶丝虫病的诊断。

研究发现, 嗜血性寄生虫(如犬恶丝虫)肠上皮细胞的“ 隐藏抗原” 能被宿主的免疫应答机制所识别, 但它们通常不会暴露在宿主的免疫系统之下, 因此, 与分泌排泄抗原或传统的暴露在虫体表面的抗原相比, 肠上皮细胞的“ 隐藏抗原” 更适合做寄生虫的重组蛋白疫苗[27]。对Di-NDPK的免疫荧光定位研究发现, NDPK蛋白分布在侧索及肠上皮细胞和肠腔中, 尤其在肠上皮细胞和肠腔中有大量的NDPK存在, 说明NDPK可能主要分泌到犬恶丝虫的肠腔中, 是其肠上皮细胞的“ 隐藏抗原” 。其次, 对兔抗rDi-NDPK抗体检测显示, rDi-NDPK具有良好的免疫原性, 与马来丝虫和利什曼原虫报道的结果一致[8, 16]。因此, 我们推测Di-NDPK可能是一个犬恶丝虫的候选疫苗基因, 其免疫保护效果还有待进一步的验证。

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