作者简介:纪艺(1995—),女,辽宁铁岭人,满族,硕士研究生,专业为生物化学与分子生物学。E-mail: jymemory12138@163.com
比较不同提取原理的试剂盒对动物生鲜肌肉组织DNA提取效果,为日常肉制品掺假检测与监测选择合适的DNA提取方法提供参考。以生鲜牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉为试验材料,采用改良CTAB法、蛋白酶K法、SDS法和快速萃取法等原理的8种不同方法来提取组织样品DNA,并对提取DNA的完整性、浓度、纯度、试验耗时和后续实时荧光定量PCR检测等指标进行评价。结果表明,8种提取方法均可用于常见动物源性肌肉DNA的提取。与改良CTAB法相比,原理为蛋白酶K法、SDS法和快速萃取法的试剂盒避免了有机试剂的使用,且操作耗时短。实际操作中,可优先选择基于蛋白酶K法和SDS法的试剂盒进行DNA提取,其提取的DNA纯度和总量高,盐残留少,对实时荧光定量PCR的抑制少,满足肉制品掺假检测与监测的核酸提取需求。
DNA extraction methods with different principles for raw animal muscle tissue were conducted and compared to define the most suitable extracting method for the daily work of detecting as well as monitoring the adulteration in meat and meat products. The eight DNA extracting methods with various principles included the traditional CTAB-, proteinase K-, SDS-and rapid extraction-based methods, and the DNA extraction were conducted on raw beef, pork, lamb, chicken and duck. Moreover, the extracted DNA was evaluated for the integrity, yield, purity, time-consuming and inhibition effects on the real-time fluorescence quantitative PCR. As a result, all eight methods could be utilized to achieve the DNA extraction from the muscle tissues of common varieties of meat. Generally, all the commercial kits that based on the proteinase K, SDS or rapid extraction principle avoided organic solvents and exhibited a time-saving character when compared with the traditional CTAB-based method. Moreover, regarding to the higher DNA yield and purity as well as the less time-consuming and little fluorescence inhibition in real-time PCR, it gave priority to choose the commercial kits with proteinase K-or SDS-based method to extract DNA. Accordingly, these commercial kits could meet the requirement of the DNA extraction for detecting or monitoring the adulteration in raw muscle tissues of common varieties of meat.
肉和肉制品是人类生活的重要营养来源。近年来, 随着食品工业的迅猛发展, 在经济利益的驱使下, 国内外一些不法分子为牟取暴利, 肉制品掺假屡禁不止, 引发人们对食品安全的恐慌[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]。因此, 开展食品掺假鉴定是保证食品安全的重要措施。以检测DNA为基础的实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、可定量和自动化程度高等优点[8, 9], 已被广泛用来鉴定食品中的动物源性成分[10, 11, 12, 13]。从动物肌肉组织中提取高质量的DNA, 是开展肉制品掺假检测和监测工作的前提与基础。
目前用于提取动物肌肉组织DNA的方法有很多, 主要包括改良CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法、PVP法及以上述方法为基础的试剂盒法[14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28]。本研究对改良CTAB法和常见商品化试剂盒进行比较分析, 为日常肉制品掺假检测提供方法依据。
生鲜牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉, 购自浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。
CTAB裂解液配方为:1%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB), 50 mmol· L-1 Tris/HCl(pH 8.0), 0.7 mol· L-1 NaCl, 10 mmol· L-1 EDTA(pH 8.0); TE缓冲液(pH 8.0)配方为:10 mmol· L-1 Tris/HCl(pH 8.0), 1 mmol· L-1 EDTA(pH 8.0); 饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1; 异丙醇; 70%乙醇。Premix Ex Taq(Probe qPCR)预混液购自日本TaKaRa公司, 引物和探针由杭州尚亚赛生物科技有限公司合成。
NanoDrop 2000核酸蛋白测定仪购自美国Thermo公司, CFX96荧光定量PCR仪和QX200型数字PCR仪购自美国Bio-rad公司, DYCP-31C型核酸电泳仪购自北京六一生物科技有限公司, ZF-258全自动凝胶成像分析系统购自上海嘉鹏科技有限公司。
1.4.1 样品处理和DNA提取
按照试剂盒说明书或方法要求称取一定量的样品, 用无菌手术刀将试验材料切成小块, 先在液氮中将样品迅速冷冻并研磨成粉末备用。采用改良CTAB法及目前国内外使用较广泛的7个动物组织DNA提取试剂盒分别对5个常见动物肌肉组织样品进行DNA提取, 每个动物样品设置3个平行重复。
改良CTAB法参考文献[28]进行, 称取50 mg样品于2 mL离心管中磨碎, 加入600 μ L CTAB裂解液充分振荡混匀, 加入等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇混合液, 充分振荡30 s, 12 000 r· min-1离心3 min后取上清液, 加0.8倍体积的异丙醇, 轻轻摇动30 s, 12 000 r· min-1离心4 min后取沉淀, 加入500 μ L 70%乙醇清洗1次, 常温干燥10~20 min后加入100 μ L TE溶液(pH 8.0)溶解, -20 ℃保存备用。
试剂盒检测共选取7款商品化动物组织DNA提取试剂盒, 其中国外品牌3个(代号为F1~F3), 4个国内品牌(代号为D1~D4)。其中, D1、F1~F3的原理为蛋白酶K法, D2和D3的原理为SDS法, D4是DNA快速萃取法, 即从组织中快速分离但不提纯DNA, 并可立即用于荧光定量PCR反应。称取不同试剂盒所需的动物肌肉组织粉末并置于2 mL离心管中, 具体操作详见试剂盒说明书。
1.4.2 DNA质量和浓度测定
取1 μ L DNA样品溶液, 用NanoDrop 2000进行DNA浓度、纯度和盐残留等指标的检测。
1.4.3 DNA完整性检测
配制1%琼脂糖凝胶, 吸取5 μ L提取的鸭DNA样品溶液与上样缓冲液混匀后加入上样孔, 120 V电泳20 min后在凝胶成像分析系统拍照留存。
1.4.4 DNA提取物对实时荧光定量PCR的抑制作用
由于目前市面上常用廉价的鸭肉作为肉制品掺假物, 本试验围绕8种提取方法提取的鸭肌肉组织DNA, 检测其是否会抑制PCR反应。以鸭肌肉组织DNA为模板, 利用TaqMan探针法实时荧光定量PCR体系来检测不同的DNA提取物是否会抑制鸭IL-2核基因的PCR扩增。参考文献[29]合成引物和探针序列, 核基因引物序列上游序列为5'-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3', 下游序列为5'-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3', 探针序列为FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1。将鸭肌肉组织DNA稀释至同一浓度后作为模板, 再进行TaqMan法进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系为:DNA模板2 μ L, 2× TaqMan反应液12.5 μ L, 10 μ mol· L-1的上下游引物各2 μ L, 10μ mol· L-1探针0.5 μ L, ddH2O补足到25μ L。PCR反应程序为:95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性10 s, 58 ℃退火延伸32 s, 共40个循环。通过Ct值的变化来探讨不同方法提取的DNA溶液是否会抑制PCR反应。
PCR扩增对模板DNA的质量要求较高。用1%琼脂糖凝胶上电泳检测核酸提取质量(图1), 改良CTAB法、3个国外品牌(F1~F3)、3个国内品牌(D1~D3)均可提纯得到条带相对单一、高分子量的肌肉组织DNA条带。与改良CTAB法和F1相比, 其他试剂盒法提取的DNA条带更亮, 表明提取的DNA浓度更高。而DNA快速萃取法(D4)提取的DNA无清晰条带, 表明在DNA提取过程中已发生较大程度的降解。
采用NanoDrop 2000核酸蛋白测定仪测定DNA浓度。鉴于每种方法的初始取样量不同, 因此将浓度均换算为每25 mg样品所提取的DNA浓度。如表1所示, 国外品牌F1试剂盒的DNA总量最低, 与鱼加工制品中的结论一致[30]; 改良CTAB法提取的DNA总量高于F1试剂盒; 其他方法提取的DNA总量要高于改良CTAB法和F1, 且提取平均总量相当。
采用NanoDrop 2000测定所提取DNA的杂质去除情况, D260/D280可用来衡量蛋白质的去除情况, D260/D230可用来衡量盐分去除情况。如表1所示, DNA快速萃取法获得的DNA纯度最低, 所有被检样本DNA的D260/D280为1.08~1.45, 表明提取的DNA中存在较多的蛋白残留。对改良CTAB法而言, 牛羊肉肌肉组织中提取核酸的纯度较低(1.6< D260/D280< 1.7), 说明存在微量的蛋白残留, 而其他3种肌肉组织DNA的提取纯度较高。试剂盒F1~F3、D1~D3提取的DNA纯度基本都在1.8~2.0之间, 说明这些试剂盒所用方法对蛋白质、RNA等杂质的处理较为得当。D260/D230数据显示, DNA快速萃取法的盐残留最多, 其次为改良CTAB法, 试剂盒D1、D3、F3提取的DNA D260/D230值在2.0以上, 说明这3个提取方法对核酸中盐分等杂质的处理较为得当。
如图2所示, 不同方法所提取的鸭源性DNA均能用于PCR扩增。当鸭肌肉组织DNA稀释至同一浓度后, 进行TaqMan法实时荧光PCR时, 除DNA快速萃取法(D4)外, 其他7种方法的Ct值都在26.83~27.30之间(表2), 说明这7种方法所提取的DNA质量均较好, 不影响PCR扩增。而DNA快速萃取法的Ct值要比其他7种方法的Ct值大, 表明该方法虽然在提取速度上占有优势, 但提取的DNA中可能存在某些PCR抑制因子, 能显著抑制PCR反应。
根据上述测定的DNA浓度、D260/D280、D260/D230、实验耗时及PCR扩增结果等数据, 对各DNA提取方法进行综合分析。改良CTAB法价格较低, 但起始量要求高, 操作烦琐, 耗时长(6 h); F1试剂盒法去除杂质、盐渍效果好, 但耗时长(6 h), DNA获得率低; F2试剂盒法去除杂质、盐渍效果好, 但价格昂贵, 耗时长(6 h); F3试剂盒耗时4 h, 但价格昂贵; D1试剂盒价格相对低廉, 提取的DNA纯度高、盐残留少, 但操作步骤烦琐; D2试剂盒提取的DNA纯度高, 获得率高, 但盐残留多, 耗时长(6 h); D3试剂盒耗时较短(4 h), 提取的DNA纯度高、盐残留少, DNA获得率高; D4试剂盒操作简便, 耗时短(3 h), 但去除杂质效果差, 纯度低, 盐残留多。
食品安全关系着人类身体健康, 是全社会关注的热点问题。近年来肉制品掺假屡禁不止, 引发人们对食品安全的恐慌, 也对食品监管部门快速、准确进行动物源性成分检验和鉴定提出了更高的要求。以DNA为基础的PCR技术已经被广泛用来鉴定食品中的动物源性成分, 而高质量、高纯度及结构完整的DNA是影响PCR扩增的重要因素。因此, 快速、稳定、优质的DNA提取方法是PCR扩增成功的关键[20]。
本研究对常见的5种常见肉类的肌肉组织进行DNA提取, 并对完整性、DNA浓度、纯度、盐残留和耗时等指标进行了对比。8种提取方法虽然均可用肌肉组织的DNA提取, 但每种方法各有利弊。改良CTAB法虽然价格实惠且对PCR扩增无抑制作用, 但其操作较为繁琐, 提取时间长, 且涉及有机溶剂抽提, 对人体有一定的潜在伤害; DNA快速萃取法耗时最短, 但DNA纯度和盐残留指标最差, 且提取的DNA溶液中含抑制PCR的成分, 影响荧光定量PCR的扩增效率; 原理为蛋白酶K法的F1试剂盒虽然去除杂质、盐渍效果较好, 但试剂盒耗时长, 且DNA得率最低, 性价比较低; 而基于蛋白酶K法和SDS法的F3和D3试剂盒的耗时相对较短, DNA的纯度高, 盐残留少, DNA总量理想, DNA提取液对实时荧光定量PCR的抑制少。
综上所述, 对常见动物肌肉组织而言, 基于蛋白酶K法和SDS法的F3和D3试剂盒在试验耗时、DNA纯度和浓度、盐残留、对荧光定量PCR的抑制等方面均优于其他试剂盒方法, 可优先选择这2种试剂盒进行DNA提取。本研究可为食物掺假和物种鉴别工作中DNA提取方法及样品处理方案提供参考。
[1] |
|
[2] |
|
[3] |
|
[4] |
|
[5] |
|
[6] |
|
[7] |
|
[8] |
|
[9] |
|
[10] |
|
[11] |
|
[12] |
|
[13] |
|
[14] |
|
[15] |
|
[16] |
|
[17] |
|
[18] |
|
[19] |
|
[20] |
|
[21] |
|
[22] |
|
[23] |
|
[24] |
|
[25] |
|
[26] |
|
[27] |
|
[28] |
|
[29] |
|
[30] |
|