引用本文
王伟科, 宋吉玲, 陆娜, 袁卫东, 闫静, 陈观平. 秀珍菇原基形成相关基因 PpFBD1的克隆与表达研究 [J]. 浙江农业学报, 2020,32(1): 93-97.
WANG Weike, SONG Jiling, LU Na, YUAN Weidong, YAN Jing, CHEN Guanping. Cloning and expression of the PpFBD1 involved in primordium formation of Pleurotus pulmonarius [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2020,32(1): 93-97.
  
Doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2020.01.12
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秀珍菇原基形成相关基因 PpFBD1的克隆与表达研究
王伟科1, 宋吉玲1, 陆娜1, 袁卫东1, 闫静1, 陈观平2
1. 杭州市农业科学研究院,浙江 杭州 310024
2. 浙江省中医药研究院,浙江 杭州 310012

作者简介:王伟科(1981—),男,浙江宁海人,学士,高级农艺师,主要从事食用菌育种与栽培技术研究。E-mail:akeok@126.com

收稿日期: 2019-06-13
基金资助: 浙江省农业(食用菌)新品种选育重大科技专项(2016C02057); 浙江省科技计划(2016F10025)
摘要

前期研究中通过对秀珍菇经低温诱导后不同发育阶段样本进行转录组测序及差异表达基因分析发现,ID为Cluster-6377.64510的基因(命名为 PpFBD1)在原基形成前期的样本中高表达。为进一步了解分析其表达特性及功能,根据转录组测序结果设计特异性引物,利用RT-PCR技术从秀珍菇中克隆获得了该基因的cDNA全长。该基因由342个核苷酸组成,编码一个由113个氨基酸组成的蛋白,蛋白相对分子质量约11 ku。进化树分析显示, PpFBD1编码蛋白与糙皮侧耳 hydrophobin1编码的疏水蛋白亲缘关系最近。Gene Ontology功能分析表明, PpFBD1主要参与真菌类细胞壁的合成。荧光定量RT-PCR检测显示,该基因在菌丝体经低温诱导后恢复至室温阶段(原基形成前期)表达量最高,这表明其可能参与调控秀珍菇原基形成过程。本研究结果为阐明秀珍菇原基形成机制提供参考。

关键词: 秀珍菇; PpFBD1; 基因克隆; 序列分析; 表达分析
中图分类号:S646.9 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2020)01-0093-05
Cloning and expression of the PpFBD1 involved in primordium formation of Pleurotus pulmonarius
WANG Weike1, SONG Jiling1, LU Na1, YUAN Weidong1, YAN Jing1, CHEN Guanping2
1. Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024, China
2. Zhejiang Academy of Chinese Medicine, Hangzhou 310012,China
Abstract

Through transcriptome sequencing and differential expression gene analysis of Pleurotus pulmonarius samples at different developmental stages induced by low temperature in the previous study, it was found that the gene with ID Cluster-6377.64510 (named as PpFBD1) was highly expressed at the prophase of primordium formation. To further understand and analyze its expression characteristics and functions, the full-length cDNA sequences of PpFBD1 was cloned from Pleurotus pulmonarius by RT-PCR method with the specific primers designed based on transcriptome data. The PpFBD1 was composed of 342 nucleotides that encode a protein consisted of 113 amino acids. The relative molecular weight of this protein is about 11 ku. Phylogenetic tree analysis showed that the protein encoded by PpFBD1 had the closest relationship with hydrophobin1 of Pleurotus ostreatus. GO functional analysis showed that the PpFBD1 mainly involved in the synthesis of fungal cell walls. Fluorescence quantitative RT-PCR detection found that the expression of the gene was the highest in the phase of mycelium recovery to room temperature after induction at low temperature. It suggested that the gene may be involved in the regulation of primordium morphogenesis in Pleurotus pulmonarius. The results of this study provided a reference for elucidating the formation mechanism of the primordium of Pleurotus pulmonarius.

Keyword: Pleurotus pulmonarius; PpFBD1; gene cloning; sequence analysis; expression analysis

食用菌从营养生长转变为生殖生长需经历菌丝萌发到原基扭结再分化成子实体这一形态上的巨大变化, 其中原基扭结形成是菌丝体向子实体转变的一个重要节点。但食用菌原基形成分化机制目前尚不明确, 因此开展与食用菌结实相关基因的研究对于了解食用菌子实体生长发育机理、选育品种及控制出菇环境均具有重要意义。

分子生物学和生物信息学的快速发展, 为食用菌子实体发生的分子机理研究提供了新思路和新方法, 使子实体发生的遗传机制研究取得了重要进展[1]。马爱民等[2]采用RAP-PCR差异显示技术对平菇菌丝体及原基、菇蕾和成熟子实体进行研究, 获得了在原基阶段差异表达的3条cDNA片段POD1、POD2与POD3, 其中POD3片段为HSP70基因片段, 说明热激蛋白在原基形成期起到重要作用。Yamada等[3]利用荧光差异显示技术在金针菇(Flammulina. velutipes)中发现了Fv-hyd1基因(编码疏水蛋白), Northern杂交结果表明, 该基因在菌丝生长期不表达, 但在原基形成期间表达量显著升高, 同时在子实体成熟期表达水平也较高, 从而推测其对金针菇结实具有调控作用。韩星、仝宗军等[4, 5]基于金针菇转录组数据对转运蛋白基因fvopt1、fvopt2以及fv-mfs1开展序列和表达分析, 发现上述基因在金针菇原基和子实体发育过程中发挥作用。周烁红等[6]从构建的肺形侧耳变温结实相关消减杂交文库中筛选到一个代表csl基因部分序列的EST, 并通过TAIL PCR技术克隆了Pp-csl1基因, 荧光定量检测结果表明, 该基因在菌丝经过5 ℃ 12 h冷处理之后的表达量最高, 说明其有可能被冷刺激诱导表达并在子实体形成过程中起重要作用。上述研究均为揭示子实体发生的遗传机制奠定了基础。

本实验前期研究中对秀珍菇低温诱导后样本及恢复到室温后原基形成前期样本进行转录组测序, 并对其中的差异表达基因进行分析, 发现基因ID为Cluster-6377.64510的基因(命名为PpFBD1)在原基形成前期的样本中高度表达, 经基因注释及Swissprot描述, 推测其很可能在原基形成中起重要作用。同时, 利用生物信息学技术获得该基因的序列全长, 并设计合成了相关引物, 利用逆转录PCR技术首次克隆了该基因, 并对基因序列、表达和功能进行了初步分析, 为进一步深入研究该基因及其可能参与的原基形成调节功能提供参考。

1 材料与方法
1.1 材料与处理

秀珍菇菌株台秀5766由浙江临安鼎新生物科技有限公司提供。母种采用PDA培养基。菌包培养基配方为杂木屑400 g· kg-1、棉籽壳400 g· kg-1、麸皮180 g· kg-1、石膏10 g· kg-1、石灰10 g· kg-1。菌包接种后于26~28 ℃条件下避光培养, 待菌丝长满菌包后(40~45 d), 选取生长良好、状态一致的菌包开展试验。取样分4组, 每组10包, 分别记为S0、S1、S2、S3。

S0, 菌丝满袋后, 挑取发菌良好的菌包料面菌丝体10 g, 立即置于-80 ℃超低温冰箱保存; S1, 菌丝满袋后, 发菌良好的菌包置于10 ℃条件下12 h, 按S0方法取样保存; S2, 菌丝满袋后, 发菌良好的菌包置于10 ℃ 条件下12 h, 再待其恢复到室温状态后, 按S0方法取样保存; S3, 经S0、S1、S2阶段后, 原基形成期取原基10 g, 立即置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取

采用Trizol法进行样本总RNA的提取[7], 样本经液氮研磨后Trizol裂解, 离心弃沉淀, 上清加入氯仿/异戊醇, 振荡混匀, 离心。上清加入1∶ 1的异丙醇, 沉淀RNA。离心弃上清, 沉淀经75%乙醇洗涤后溶于50 μ L DEPC水中。

1.2.2 cDNA的合成

总RNA经1.2%琼脂糖凝胶电泳及核酸分析仪检测纯度和浓度后, 按照Bio-Rad公司的iScript cDNA Synthesis Kit合成cDNA。

1.2.3 基因克隆

根据RNA-seq测序结果, 选取PpFBD1基因序列。并运用引物设计软件Primer Premier 5.0设计相关引物如下:上游引物为5'-ATGTTCTCCATCCGCATCTCC-3', 下游引物为5'-CGCCCATCAAACTCCTCTAA-3'。

以反转录后获得的cDNA为模板进行PCR扩增, 以Thermo Fisher的AccuPrime Pfx DNA Polymerase为扩增酶, 建立25 μ L反应体系:10× Pfx缓冲液2.5 μ L, 50 mmol· L-1 MgSO4 0.5 μ L, 25 mmol· L-1 dNTP 1.0 μ L, 10 mmol· L-1引物各1.0 μ L, cDNA模板5.0 μ L, Pfx DNA Polymerase 0.5 μ L, ddH2O 13.5 μ L。

反应条件为:93 ℃预变性3 min; 93 ℃ 30 s, 53 ℃ 30 s, 72 ℃延伸30 s, 30个循环; 72 ℃延伸7 min。扩增产物经1.2 %琼脂糖电泳后, 用DNA胶回收试剂盒纯化回收。连入T载体(PMD18-T, TaKaRa), 转化大肠埃希菌菌株JM109, 蓝白斑筛选, 提取质粒DNA进行酶切鉴定, 阳性克隆送北京擎科生物技术有限公司测序。

1.2.4 基因的生物信息学分析

主要采用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast、http://www.bio-soft.net/sms/index.html、http://amigo.geneontology.org/、http://www.uniprot.org 等网上软件包进行生物信息学分析。使用Vector NTI软件对序列进行多重比对, 并用MEGA 5.0软件构建进化树。

1.2.5 基因表达分析

试剂盒提取秀珍菇S0、S1、S2、S3四个阶段总RNA, 并按照iScript cDNA Synthesis Kit合成cDNA, 根据PpFBD1基因序列设计出特异性qRT-PCR引物(表1), 以Actin作为内参基因, 用qRT-PCR的方法检测PpFBD1基因在秀珍菇不同采样阶段的相对表达量[8]。PpFBD1和Actin的退火温度均为53 ℃, 每个样品设3重复。按2-Δ Δ Ct法计算基因相对表达量。

表1 qRT-PCR反应引物序列 Table 1 Primer sequence of qRT-PCR
2 结果与分析
2.1 PpFBD1序列的获得及序列分析

利用RT-PCR技术从秀珍菇中得到350 bp左右的DNA片段, 克隆至PMD18-T载体后测序, 将测序结果与GenBank中登录基因进行同源性比较分析, 获得342 bp全长序列, 命名为PpFBD1。BLAST显示其与糙皮侧耳hydrophobin1基因(GenBank:Y14656.1)100%相似。

通过ORF Finder寻找PpFBD1的开放读码框, 显示其包含1个342 bp的ORF框, 推断其为编码113个氨基酸的功能蛋白。由Vector NTI软件推算该编码蛋白的相对分子质量约为11 ku。SMART工具预测显示该蛋白质C端含有一个由77个氨基酸组成的保守区域(HYDRO), 说明所获基因属于疏水蛋白家族。

2.2 PpFBD1基因编码蛋白系统进化分析

利用MEGA5.0 软件对秀珍菇PpFBD1基因编码氨基酸序列开展进化树分析, 显示秀珍菇PpFBD1编码的蛋白与糙皮侧耳同源蛋白亲缘关系最近, 与其他真菌同源蛋白的亲缘关系较远(图1)

图1 秀珍菇PpFBD1基因编码氨基酸系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of the amino acid encoded by PpFBD1 of Pleurotus pulmonarius

2.3 PpFBD1的GO功能分析

GO功能分析显示, PpFBD1编码蛋白为细胞壁的结构成分(图2), 其主要参与了真菌类细胞壁的合成。

图2 PpFBD1蛋白的亚细胞定位Fig.2 Subcellular location of protein encoded by PpFBD1 of Pleurotus pulmonarius

2.4 不同生长阶段秀珍菇PpFBD1的表达情况

在秀珍菇生长发育过程中的4个不同阶段PpFBD1均有表达。其中, S1阶段(低温刺激阶段)PpFBD1的表达量要高于S0阶段, 说明低温刺激对PpFBD1的表达起一定程度的诱导作用; 而S2阶段(原基形成前期)PpFBD1的表达量明显要高于S0及S1阶段, 说明PpFBD1虽然受一定程度的低温诱导, 但更有可能是原基形成的小分子诱导蛋白; S3(原基形成期)阶段其表达量又有所下降, 进一步说明其可能在促使原基扭结形成这一过程中发挥重要作用。

图3 PpFBD1在秀珍菇不同生长阶段表达量Fig.3 Relative expression of PpFBD1 gene in different growth stages

3 讨论

秀珍菇作为一种具有重要经济价值、食用价值和营养价值的食用菌类, 其子实体发育分子机制的研究及发育相关功能基因的鉴定分析一直是一项复杂且具有重要理论和实际意义的工作[9, 10, 11]。

本研究基于秀珍菇转录组测序结果, 发现PpFBD1在原基形成前期的样本中高度表达。利用RT-PCR技术从秀珍菇中克隆了该基因, 测序获得核酸序列并推测了其蛋白序列。比对发现该基因序列与糙皮侧耳hydrophobin 1基因一样。蛋白质序列包括一个HYDRO疏水保守区域, 说明该基因编码的蛋白为疏水蛋白。

研究表明, 疏水蛋白具有诱导形态发育等相关功能, 疏水蛋白作为天然表面活性剂, 可降低水表面张力, 从而使真菌菌丝突破水-空气界面, 进而诱导产生气生菌丝结构[12, 13]。Ohm等[14]通过裂褶菌(Schizophyllum commune)的基因组和表达谱分析发现, 在裂褶菌子实体生长发育过程菌丝扭结阶段, 与疏水蛋白相关的基因表达均出现不同程度的升高, 这表明疏水蛋白在子实体生长发育过程中直接或间接起着重要作用。陈仁良等[15]通过分析金针菇不同生长发育阶段的表达谱, 发现疏水蛋白Fv-Hyd1的表达在菌丝扭结阶段和原基期均升高, 且远高于其他时期, 这与本次我们在秀珍菇中的研究结果相似。

本研究中发现的PpFBD1编码的蛋白为小分子疏水蛋白, 在秀珍菇营养生长到生殖生长的不同阶段表达量存在明显差异, 低温处理后原基形成前期表达量明显要高于其他3个时期, 这说明其可能与原基形成和分化有关, 具体功能有待深入研究。

(责任编辑 张韵)

参考文献
[1] 宋林丽, 邢晓科, 郭顺星. 大型真菌子实体发生的形态学过程及调控机制[J]. 菌物学报, 2018, 37(6): 671-684.
SONG L L, XING X K, GUO S X. Morphological process and regulation mechanisms of fruiting body differentiation in macrofungi: a review[J]. Mycosystema, 2018, 37(6): 671-684. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[2] 马爱民, 关海山. 平菇子实体分化发育相关基因片段的克隆[J]. 华中农业大学学报, 2001, 20(4): 299-302.
MA A M, GUAN H S. Cloning of differentiation and development related gene fragments in Pleurotus ostreatus[J]. Journal of Huazhong Agricultural, 2001, 20(4): 299-302. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[3] YAMADA M, SAKURABA S, SHIBATA K, et al. Cloning and characterization of a gene coding for a hydrophobin, Fv-hyd1, specifically expressed during fruiting body development in the basidiomycete Flammulina velutipes[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 67(2): 240-246. [本文引用:1]
[4] 韩星, 魏仲阳, 张晔琳, 等. 金针菇寡肽转运蛋白编码基因fvopt1与fvopt2的鉴定与表达分析[J]. 食用菌学报, 2018, 25(4): 17-23.
HAN X, WEI Z Y, ZHANG Y L, et al. Identification and expression analysis of two oligopeptide transporter encoding genes fvopt1 and fvopt2 from Flammulina velutipes[J]. Acta Edulis Fungi, 2018, 25(4): 17-23. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[5] 仝宗军, 严俊杰, 张磊, 等. 金针菇转运蛋白基因fv-mfs1的序列与表达分析[J]. 食用菌学报, 2017, 24(3): 1-6.
TONG Z J, YAN J J, ZHANG L, et al. Sequence and expression analysis of transporter protein gene fv-mfs1 in Flammulina velutipes[J]. Acta Edulis Fungi, 2017, 24(3): 1-6. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[6] 周烁红, 沈颖越, 蔡为明, 等. 肺形侧耳变温结实相关基因Ppcsl-1的克隆及功能预测[J]. 菌物学报, 2016, 35(8): 946-955.
ZHOU S H, SHEN Y Y, CAI W M, et al. Cloning and functional prediction of the Ppcsl-1 related to change-temperature fruiting of Pleurotus pulmonarius[J]. Mycosystema, 2016, 35(8): 946-955. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[7] 闫述模, 袁媛, 杨滨, 等. 一种适用于不同发育期山楂果实总RNA提取的方法[J]. 中国实验方剂学杂志, 2016, 22(14): 39-43.
YAN S M, YUAN Y, YANG B, et al. Good method for isolating total RNA from Crataegi fructus at different developmental stages[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2016, 22(14): 39-43. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[8] 崔波, 王洁琼, 宋彩霞, 等. 蝴蝶兰SOC1基因的克隆及表达分析[J]. 分子植物育种, 2016, 14(3): 548-553.
CUI B, WANG J Q, SONG C X, et al. Cloning and expression analysis of SOC1 gene from Phalaenopsis[J]. Molecular Plant Breeding, 2016, 14(3): 548-553. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[9] 沈颖越, 顾敏, 蔡为明, 等. 秀珍菇子实体发育相关消减杂交cDNA文库的构建与分析[J]. 浙江农业学报, 2014, 26(2): 330-334.
SHEN Y Y, GU M, CAI W M, et al. Construction and analysis of a suppressive subtractive hybridisation cDNA library related to fruiting body formation of Pleurotus pulmonarius after cold stimulation[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2014, 26(2): 330-334. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[10] SAKAMOTO Y, NAKADE K, SATO T. Characterization of the post-harvest changes in gene transcription in the gill of the Lentinula edodes fruiting body[J]. Current Genetics, 2009, 55(4): 409-423. [本文引用:1]
[11] 王伟科, 宋吉玲, 闫静, 等. 秀珍菇转录组测序和初步分析[J]. 南京农业大学学报, 2019, 42(2): 292-299.
WANG W K, SONG J L, YAN J, et al. Transcriptome sequencing and analysis of Pleurotus pulmonarius[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(2): 292-299. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[12] MORRIS V K, KWAN A H, MACKAY J P, et al. Backbone and sidechain1H, 13C and 15N chemical shift assignments of the hydrophobin DewA from Aspergillus nidulans[J]. Biomolecular NMR Assignments, 2012, 6(1): 83-86. [本文引用:1]
[13] SUNDE M, KWAN A H Y, TEMPLETON M D, et al. Structural analysis of hydrophobins[J]. Micron, 2008, 39(7): 773-784. [本文引用:1]
[14] OHM R A, DE JONG J F, LUGONES L G, et al. Genome sequence of the model mushroom Schizophyllum commune[J]. Nature Biotechnology, 2010, 28(9): 957-963. [本文引用:1]
[15] 陈仁良, 李肖, 龙莹, 等. 金针菇疏水蛋白Fv-Hyd1及其潜在的转录因子Fv-Rtg3的共表达分析[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2016, 42(3): 313-320.
CHEN R L, LI X, LONG Y, et al. Analysis on the co-expression of hydrophobin fv-Hyd1 and its potential transcription factor fv-Rtg3 in Flammulina velutipes[J]. Journal of Zhejiang University( Agriculture and Life Sciences), 2016, 42(3): 313-320. (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]