决明子抗氧化作用机制的网络药理学分析
李磊, 赵花金, 伍子焘, 李升和, 姜锦鹏, 刘畅*
安徽科技学院 动物科学学院,农业农村部猪肉质量安全控制重点实验室,动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100
*通信作者,刘畅,E-mail:liuchang052@126.com

作者简介:李磊(1984—),男,内蒙古呼和浩特人,博士,副教授,主要从事兽医药理学与毒理学研究。E-mail:leilee_1984@163.com

摘要

中药决明子抗氧化作用显著但作用机制仍不清楚,本文旨在运用网络药理学研究方法,阐释决明子的抗氧化作用机制。通过文献和中药系统数据库TCMSP获取决明子的所有化学成分,再根据口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和类药性(drug-likeness,DL)筛选出其活性成分及其对应靶点。通过GeneCards数据库查找并预测决明子抗氧化作用靶点,将靶点导入STRING数据库构建靶点间蛋白互作关系,并使用Cytoscape软件进行可视化处理。通过DAVID数据库对靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。利用AutoDock软件对预测结果进行分子对接验证。最终共筛选出决明子抗氧化作用活性成分11个,抗氧化作用靶点34个,这些靶点主要富集于氧化还原过程(oxidation-reduction process)、正调控活性氧代谢过程(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)等51个生物过程,参与了乙型肝炎相关通路(hepatitis B)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)和癌症信号通路(pathway in cancer)等154条信号通路。分子对接证实芦荟大黄素、决明内酯等成分可与对应靶点结合,进一步验证了网络药理学预测的可靠性。本研究发现决明子可通过大黄酸、芦荟大黄素、豆甾醇、决明内酯等11种成分作用于TP53、MYC、CASP3、ESR1、JUN等34个靶点发挥抗氧化作用,反映了决明子经多靶点、多途径发挥抗氧化作用的特点,为深入研究决明子抗氧化作用机制提供了参考。

关键词: 决明子; 网络药理学; 抗氧化; 蛋白互作网络
中图分类号:S567.21+9;R967 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2020)10-1855-11
Network pharmacological analysis of anti-oxidant mechanism of Cassia semen
LI Lei, ZHAO Huajin, WU Zitao, LI Shenghe, JIANG Jinpeng, LIU Chang*
Anhui Province Key Laboratory of Animal Nutritional Regulation and Health, Key Laboratory of Quality & Safety Control for Pork, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China
Abstract

Cassia semen is good at anti-oxidant, however the mechanism is unknown. The aim of the study was to investigate the anti-oxidative mechanisms of Cassia semen by the network pharmacological method. According to literature mining and TCMSP database of the Chinese medicine system, all the chemical components and the targets of Cassia semen were obtained. Then, the corresponding targets and the active components were selected according to oral bioavailability (OB) and drug-likeness (DL). GeneCards database was used to identify and predict the anti-oxidative targets of Cassia semen. STRING database and Cytoscape software were used to construct protein-protein interaction network. GO and KEGG enrichment analysis was preformed through DAVID database. The predicted targets were finally confirmed by molecular docking with AutoDock software. It was found that 11 ingredients and 34 targets were involved in 51 biological process GO terms (including oxidation-reduction process, positive regulation of reactive oxygen species metabolic process) and 154 KEGG pathways (including hepatitis B, p53 signaling pathway, TNF signaling pathway, non-alcoholic fatty liver disease and pathway in cancer). The predicted targets of Cassia semen were confirmed by molecular docking, which indicated the reliability of the network pharmacology approach. In conclusion, Cassia semen, including rhein, aloe-emodin, stigmasterol, toralactone etc. Eleven active ingredients, played its anti-oxidative role by interacting with 34 targets including TP53, MYC, CASP3, ESR1, JUN etc, which suggested the characteristic of multi-targets and multi-pathways of Cassia semen and provided a reference for further investigation.

Keyword: Cassia semen; network pharmacology; antioxidation; protein-protein interaction network

氧化应激是指在各种应激条件下机体氧化还原反应失衡, 体内活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成水平超过机体抗氧化系统对ROS的清除能力, 导致氧自由基在体内聚积, 进而引发细胞受损甚至死亡, 是导致神经退行性疾病、心血管疾病、癌症和衰老等过程的主要原因之一[1, 2, 3, 4]。增强机体抗氧化能力可有效提高机体抗病能力, 具有多重保健作用。近年来发现, 多种中药均含有大量抗氧化成分, 对于治疗氧化应激引发的相关疾病具有独到的优势[5]。目前, 对传统中药及其有效成分抗氧化作用的研究发现, 核因子κ B(nuclear factor-κ B, NF-κ B)、核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2)、Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH associated protein 1, Keap1)等信号通路是调控机体抗氧化应激损伤的关键途径[6], 受到研究者的大量关注。

决明子是豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)或小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子, 最早记载于《神农本草经》, 为最常见的药食同源中药材[7]。研究发现, 决明子的活性成分主要包括蒽醌、萘并吡喃酮、脂肪酸、多糖、氨基酸等, 具有极高的药用与营养价值[8]。现代药理学研究发现, 决明子具有良好的降压、降脂、降糖、保肝、明目、抗氧化等多重药理活性[8, 9, 10], 其水提物能够有效清除羟自由基、超氧阴离子自由基和1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基[9]。此外, 决明子可降低衰老小鼠脑组织、CCl4诱导的肝损伤小鼠血清丙二醛水平, 同时提高超氧化物歧化酶水平而发挥抗氧化作用[8]。鉴于中药成分复杂, 目前关于决明子的药理研究主要集中于药效评价, 对于其作用机制的深入研究仍较少[7, 8, 9, 10, 11]。因此, 本研究基于网络药理学策略从系统生物学角度揭示决明子抗氧化应激作用机制, 以期为深入研究决明子药理作用机制及其临床应用提供参考。

1 材料与方法
1.1 决明子活性化合物及其对应靶点的获取

通过文献和中药系统药理数据库TCMSP[12](http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)获取中药决明子的所有化学成分。根据口服生物利用度(oral bioavailability, OB)和类药性(drug-likeness, DL)将每个化学成分的筛选阈值分别设为OB≥ 30%, DL≥ 0.18, 找出决明子的活性化合物及其对应靶点。运用Uniprot蛋白数据库[13](http://www.uniprot.org)将靶点名称转化为基因名称, 将检索的条件物种(Organism)设置为Homo sapiens, 得到决明子潜在作用靶点。

1.2 构建决明子抗氧化成分-靶点网络

通过GeneCards数据库[14](https://www.genecards.org)查找与抗氧化(anti-oxidant)有关的标靶基因。将决明子活性成分靶点与抗氧化有关的靶点基因映射。再将获得的决明子有效成分与靶点信息通过Cytoscape 3.6.0软件[15]构建决明子抗氧化成分-靶点网络。

1.3 蛋白-蛋白互作(PPI)网络的构建

将上述决明子抗氧化作用靶点输入STRING数据库[16](https://string-db.org), 将筛选物种设置为Homo sapiens。初步得到决明子作用于抗氧化的蛋白互作网络, 下载蛋白互作网络的数据, 输入Cytoscape 3.6.0软件, 构建决明子抗氧化作用靶点蛋白— 蛋白互作网络, 并对网络进行拓扑分析。

1.4 靶点的GO功能富集分析与KEGG信号通路富集分析

将所得到的决明子作用于抗氧化的核心靶点蛋白导入DAVID数据库[17, 18](https://david.ncifcrf.gov), 物种选择为Homo sapiens, 得到基因本体论(gene ontology, GO)富集分析与京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析。选择假定值(P-value)小于0.05的条目作为显著富集的GO条目或KEGG通路。

1.5 分子对接

通过PubChem数据库下载决明子成分的化学结构SDF文件, 利用Chem 3D软件将其能量最小化并另存为mol2格式文件。从PDB数据库检索并下载靶点的PDB文件, 分别输入AutoDockTools 1.5.6将药物分子与靶点蛋白经过去水、加氢等处理并转化为PDBQT文件。设置对接参数为默认值, 运用AutoDock 4.2软件[19]进行分子对接, 将对接结果输入LigPlot+软件[20]分析药物分子与靶点间相互作用类型, 用于评价决明子化学成分与其对应靶点的结合能力。

2 结果与分析
2.1 决明子有效化合物及其对应靶点

通过检索文献和TCMSP数据库得到中药决明子共有68个化学成分, 符合筛选条件的成分共14个(表1)。其中, 红镰霉素没有对应靶点, 其余13种化学成分对应靶点经去重处理后共得到67个靶点, 选择物种为人类, 去除掉1个非人源靶点, 最终得到决明子活性成分对应靶点基因66个。

表1 决明子有效成分与靶点信息 Table 1 Ingredients and targets of Cassia semen
2.2 决明子抗氧化有效成分— 靶点网络

通过GeneCards数据库找到抗氧化的标靶基因813个, 与决明子活性成分对应靶点交集为34个。利用Cytoscape 3.6.0软件将决明子活性成分与抗氧化相关靶点构建网络模型(图1)。其中, 11个红色节点为决明子潜在抗氧化活性成分, 34个绿色节点为决明子抗氧化作用的潜在靶点。以上结果表明, 决明子抗氧化作用可能由大黄酸、芦荟大黄素、橙黄决明素、决明素等11个有效成分作用于PTGS1、PTGS2、TP53、JUN、CASP3、ESR1等34个靶点实现。

图1 决明子“ 成分-靶点” 网络图
红色三角形节点表示决明子抗氧化作用有效成分, 绿色椭圆形节点表示决明子的潜在抗氧化作用靶点。
Fig.1 Components-targets network of the main ingredients of Cassia semen
The red triangular nodes represented the active ingredients of Cassia semen, and the green elliptical nodes represented the anti-oxidative associated targets of Cassia semen.

2.3 决明子抗氧化的蛋白互作(PPI)网络构建

将决明子抗氧化作用靶点信息输入STRING数据库得到这些靶点间的互作关系, 通过Cytoscape构建靶点PPI网络(图2)。图中包括34个节点、177条边线。节点的颜色和大小反映了靶点的连接度(degree), 颜色由绿变红、节点越大表示该靶点degree越大, 说明该节点在网络中具有更重要的作用。边的线条粗细反映了靶点间结合分值(combine score)的大小, 线条越粗表示2个靶点的结合分值越大。在该网络中degree排在前10位的靶点依次为TP53(25)、MYC(22)、CASP3(21)、ESR1(20)、JUN(20)、CDKN1A(18)、PTGS2(16)、TNF(16)、CCNB1(15)、MAPK14(14)。

图2 决明子抗氧化作用靶点的蛋白互作网络图
节点颜色由绿变红、由小变大表示节点连接度(degree)逐渐增大; 节点间联系由细变粗表示节点间结合分值(combine score)逐渐增大。
Fig.2 PPI network of anti-oxidative targets of Cassia semen
The nodes in the network represented the potential targets, and the edges represented the interaction between the targets. The color from green to red and the size from small to big represented larger degree of targets, and the thickness of the line indicated the combine score of the targets.

2.4 GO富集分析结果

将决明子抗氧化靶点输入DAVID数据库, 进行GO富集分析, 设置P-value< 0.05, 全部34个靶点共富集到76条GO条目中, 其中包含Ras蛋白信号转导(Ras protein signal transduction)、细胞增殖调控(regulation of cell proliferation)、正调控热量生成(positive regulation of fever generation)、正调控成纤维细胞增生(positive regulation of fibroblast proliferation)、肽-丝氨酸磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、氧化还原过程(oxidation-reduction process)、正调控活性氧代谢过程(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)等51条与生物过程(biological process, BP)相关的GO条目(图3, 仅列出排名靠前的20条GO条目)。这些靶点还富集到胞浆(cytosol)、细胞外泌体(extracellular exosome)、中心体(centrosome)、PCNA-p21复合体(PCNA-p21complex)、线粒体外膜(mitochondrial outer membrane)、线粒体(mitochondrion)等14个与细胞组分(cellular components, CC)相关的GO条目中(图4)。另外, 这些靶点还可富集到染色质结合(chromatin binding)、核心启动子结合(core promoter sequence-specific DNA binding)、RNA多聚酶II转录因子活性(RNA polymerase II transcription factor activity)等11个与分子功能(molecular functions, MF)相关的GO条目中(图5)。表明决明子有效成分可以通过调控细胞内多种部位、多种功能的多种生物学过程进而发挥其抗氧化作用。

图3 GO生物过程富集分析气泡图Fig.3 Bubble plot of GO enrichment analysis of biological process

图4 GO细胞组分富集分析气泡图Fig.4 Bubble plot of GO enrichment analysis of cellular components

图5 GO分子功能富集分析气泡图Fig.5 Bubble plot of GO enrichment analysis of molecular functions

2.5 KEGG富集分析结果

将决明子34个抗氧化靶点输入DAVID数据库, 设置P-value< 0.05, 这些靶点可富集到154条信号通路中, 其中排名前20的通路如图6所示。在排名前20的通路中, 共28个靶点富集到与癌症、内分泌与代谢疾病, 以及感染性疾病等与人类疾病相关的12条通路, 12个靶点富集到细胞增殖和死亡等与细胞过程(cellular processes)相关的2条通路, 12个基因富集到信号传导等与环境信息处理(environmental information processing)相关的2条通路; 另外有19个靶点富集到与生物系统(organismal systems)相关的4条通路, 其中乙型肝炎相关通路(Hepatitis B)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)和癌症信号通路(pathway in cancer)等均与氧化应激反应密切相关, 表明决明子可以通过多种途径对抗机体氧化应激反应。

图6 KEGG富集分析气泡图Fig.6 Bubble plot of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子对接结果

为了验证预测靶点的可靠性, 采用分子对接技术验证了排名前5的靶点与相应成分之间的相互作用(表2)。结果发现, 芦荟大黄素可与TP53蛋白TRP1495、TYR1502、PHE1519、ASP1521、TYR1523、LEU1547、ALA1585等残基形成疏水相互作用, 同时与MET1584(2.73 Å )形成氢键, 保证了其与TP53具有较强的结合能力(图7-A); 同时, 芦荟大黄素可占据MYC蛋白HIS51、GLY53、ALA55、PRO57、ASN59等残基形成疏水活性空腔, 并与HIS50(2.87 Å )、ALA55(2.99 Å )、GLU58(2.83 Å )形成氢键而发生结合(图7-B)。此外, CASP3蛋白GLU191、ASN195、LEU196可形成疏水空腔, 芦荟大黄素一方面可与该空腔结合, 同时能与THR192(2.63 Å )、ALA361(3.01 Å )、ASP362O(3.28 Å )、ASP362N(3.21 Å )、LEU357(3.08 Å )、LYS358(2.85 Å )等残基形成氢键(图7-C), 保证了二者的结合能力。

表2 决明子部分成分与靶点分子对接结果 Table 2 Results of molecular docking for ingredients of Cassia semen and associated targets

类似地, 决明内酯能够占据由LEU346、ALA350、ASP351、LEU354、TRP383、MET421、LEU525、VAL533、VAL534、PRO535共10个残基形成的ESR1疏水活性空腔, 并与ESR1蛋白MET343(2.99 Å )、THR347(3.04 Å )氨基酸残基形成氢键(图7-D)。小分子9, 10-二羟基-7-甲氧基-3-亚甲基-4H-苯并[g]异色烯-1-酮与ESR1蛋白的相互作用与决明内酯类似(图7-E)。

图7 分子对接结果
芦荟大黄素与(A)TP53、(B)MYC、(C)CASP3的分子对接结果; D、E为决明内酯、9, 10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4h-benzo[g]isochromen-1-one分别与ESR1分子对接的结果; F为大黄酸与JUN的分子对接结果。
Fig.7 Results of molecular docking
Molecular docking results of alon-emodin with TP53(A), MYC(B), CASP3(C); Toralactone (D) and 9, 10-dihydroxy-7-methoxy-3-methylene-4h-benzo[g]isochromen-1-one (E) docking with ESR1; Rhein docking with JUN(F).

大黄酸与JUN蛋白的MET313残基可形成疏水作用, 并与LYS309(2.73 Å )、VAL312(2.79 Å )、ASN314(3.07 Å )、TYR315(3.26 Å , 2.88 Å )4个氨基酸残基形成5个氢键(图7-F)。以上结果进一步验证了网络药理学对决明子抗氧化作用靶点预测的可靠性。

3 讨论

本研究采用网络药理学方法分析了决明子抗氧化作用机制, 对决明子有效成分、抗氧化作用靶点进行了预测, 构建了决明子抗氧化作用靶点网络, 并对这些靶点进行了GO与KEGG富集分析。结果发现, 决明子中11种有效成分可以作用于分布在细胞胞浆、细胞核、线粒体等多个细胞组分中的34个相关靶点, 这些靶点可以通过参与细胞氧化还原反应、调控活性氧代谢、调控细胞增殖等多种途径发挥抗氧化作用。

已发现的决明子成分约有68个化合物, 经过网络药理学研究发现, 其中11个成分为潜在抗氧化作用有效成分, 其中, 大黄酸、芦荟大黄素、豆甾醇、决明内酯等成分的抗氧化活性已有报道。如嗜脂性蒽醌类化合物大黄酸具有保肝、保肾、抗炎、抗氧化、抗癌和抗菌活性。Zhong等[21]报道, 大黄酸通过下调BIDCASP3、CAPS8、CASP9基因表达, 并增加SOD、GSH-PX等抗氧化酶活性来保护过氧化氢诱导的HUVEC细胞氧化损伤。芦荟大黄素也属于蒽醌类化合物, 其中含有酚羟基, 而酚羟基是许多天然抗氧化剂的功能基团, 这使得芦荟大黄素对氧自由基有较强的清除能力[22]; 同时, 芦荟大黄素抗氧化作用可能与其抑制MYC、NF-κ B, 提高BAX、FAS、TP53、CASP3、ERK1/2等蛋白表达水平有关; 另外, 芦荟大黄素可作用于MAPKs、PKC、NF-κ B、ROS-JNK、PI3K/AKT/mTOR和线粒体信号通路, 这些通路均与调控机体氧化还原反应密切相关:因此, 也可能是芦荟大黄素抗氧化作用的主要机制[23]。在本研究中, 采用网络药理学预测得到的芦荟大黄素抗氧化作用靶点与上述研究高度重合, 并且通过分子对接验证了芦荟大黄素与TP53、MYC、CASP3的相互作用(图7), 证明了网络药理学预测的可靠性。豆甾醇是天然植物中的一种活性化合物, 不同浓度的豆甾醇均具有一定的抗氧化活性[24]。Sun等[25]报道, 豆甾醇可通过减轻氧化应激和自噬保护缺血再灌注损伤造成的神经损伤。决明内酯属于萘并吡喃酮类化合物, 具有保肝、抗突变和降脂作用[26]。Seo等[27]报道, 决明内酯可以通过Nrf2介导的抗氧化信号通路对抗叔丁基过氧化氢诱导的肝损伤。

在决明子抗氧化作用靶点网络中, TP53、MYC、CASP3、ESR1、JUN等5个靶点的连接度较高(大于所有连接度中位数的2倍), 属于该网络的核心节点, 可能是决明子抗氧化作用的关键靶点, 为此, 我们采用分子对接技术进行了验证(表2)。研究发现, TP53参与调控机体氧化还原反应, 对于维持氧化还原平衡至关重要。当TP53基因发生突变时, 往往伴随严重的氧化应激损伤, 如在癌细胞中, 突变的TP53基因与野生型基因相比抗氧化作用消失, 导致癌细胞中ROS含量增加, 促进了癌细胞存活[28, 29, 30]MYC是一种编码核磷蛋白的原癌基因, 在细胞周期、细胞凋亡与细胞转化中发挥重要作用。正常情况下, MYC主要参与调控胚胎发育和组织修复, 但异常表达的MYC可以促进细胞恶性转化。在癌细胞中异常表达的MYC可以引起基因的非线性扩增, 使某些mRNA异常表达, 导致细胞代谢失衡, 诱发细胞氧化应激, 促进了细胞死亡或肿瘤的形成和发展[31, 32]TP53与MYC间存在负相关关系, TP53可在转录水平抑制MYC的表达, 其下游基因p21也可以抑制MYC表达; 另外, TP53还可以通过调控miR-145、miR-34b进而抑制MYC表达[33]。JUN是组成转录因子AP-1的重要亚基, 可与DNA上的特异序列结合调控相关基因转录, JUN是TP53表达与激活的负调控因子, 在c-jun-/-成纤维细胞中TP53的表达显著高于正常细胞, 当在c-jun-/-细胞中稳定表达c-jun后, TP53的表达水平显著降低, 这表明JUN可以负调控TP53的表达[34]。对决明子抗氧化靶点进行GO富集分析发现, TP53、CDKN1A、MAPK14、MAOAMAOBPTGS1、NOS2等基因可以富集到氧化还原过程(oxidation-reduction process)、正调控活性氧代谢过程(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)等生物过程中; 而KEGG通路富集分析发现, 决明子抗氧化作用靶点主要富集在癌症相关通路(如p53 signaling pathway, pathway in cancer, proteoglycans in cancer, viral carcinogenesis, colorectal cancer等)和肝损伤相关通路(如hepatitis B, non-alcoholic fatty liver disease)。氧化应激是癌症与肝损伤等疾病的共同原因, 缓解机体氧化应激损伤是治疗癌症与肝损伤等疾病的常用策略。网络药理分析发现, 决明子中的多种成分可经多个靶点在抗癌与保肝方面发挥作用, 可能具有一定的应用前景。

决明子作为药食两用中药, 日常生活中常可代茶饮, 其保肝降脂功效已被人们熟知并认可[35, 36]。目前, 关于决明子及其有效成分基于抗氧化应激途径的抗癌作用研究尚未见报道, 可作为今后研究的方向加以探索。本研究从系统药理学角度预测了决明子的抗氧化作用机制, 但仍需通过体内、外试验进一步验证。

(责任编辑 侯春晓)

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