供试的小麦品种为安农1314; 病原菌为小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum), 来源于安徽农业大学植物保护学院病理教研室。培养基为牛肉膏蛋白胨培养基(NA), 固体和液体培养基配置方法与配方参照文献[11, 12]。试验中用到的抗生素包括卡那霉素(kanamycin, Kan)和利福平(rifampin, Rif)。

1.2.1 芽孢杆菌DZSG23的抗生素标记

选择200 μ g· mL^-1 Kan、20 μ g· mL^-1 Rif对芽孢杆菌DZSG23开展双抗药性标记, 具体方法参照苏博等^[12]的方法。以生长稳定、菌落形态和生长曲线稳定、抑菌作用稳定等为指标筛选双抗标记菌株DZSG23^{Kan, Rif}。

1.2.2 抗药菌株DZSG23^{Kan, Rif}遗传稳定性试验

将获得的抗性菌株DZSG23^{Kan, Rif}接种在未添加抗生素的NA培养基上, 继代培养10代后接种到添加抗生素的NA培养基上, 继代培养10代; 然后分别检测DZSG23^{Kan, Rif}在添加抗生素和未添加抗生素的NA培养基上的细菌含量, 比较其抗药性水平差异。选择平板对峙法检测DZSG23^{Kan, Rif}菌株和DZSG23菌株对禾谷镰孢的抑菌活性, 各处理重复3次。

1.2.3 抗药菌株DZSG23^{Kan, Rif}在小麦苗期定殖量的测定

在NA液体培养基中添加200 μ g· mL^-1 Kan、20 μ g· mL^-1 Rif, 接入DZSG23^{Kan, Rif}, 置于37 ℃、200 r· min^-1的摇床上培养24 h, 待菌液中浓度达到1× 10⁶ CFU· mL^-1左右时备用。供试小麦种子催芽24 h, 选择露白情况一致的种子按照如下设计要求开展试验:

无菌水处理(CK):随机选择露白情况一致的种子播种在温室花盆中, 每个花盆统一播种5粒, 并浇入提前灭菌冷却的蒸馏水(50 mL· 盆^-1), 做好标记。

灭菌NA液体培养基处理(NA):随机选择露白情况一致的种子播种在温室花盆中, 每个花盆统一播种5粒, 并浇入提前灭菌冷却的NA液体培养基(50 mL· 盆^-1), 做好标记。

抗药菌株DZSG23^{Kan, Rif}处理(S):随机选择露白情况一致的种子在抗药菌株DZSG23^{Kan, Rif}的菌悬液中浸泡5 h, 捞出播种在温室花盆中(每个花盆播种5粒), 并浇入提前灭菌冷却的NA液体培养基(50 mL· 盆^-1), 做好标记。

播种后的第7、10、15、18、22、27、34天, 分别在每个处理中取3株长势一致的小麦植株, 分离根际的土壤进行称量, 加入适量的无菌水混合均匀, 置于37 ℃、200 r· min^-1摇床中培养20 min后静置一段时间, 取上清液进行梯度稀释, 分别吸10^-4、10^-5稀释液100 μ L涂布于添加抗生素的NA固体培养基上, 2种稀释液均涂布3个平皿作为重复。之后转移到37 ℃培养箱中培养, 24 h后对长出的抗性菌株单菌落进行数量统计, 最后折算出单位质量土壤中的单菌落数。

对上述3个处理的小麦植株进行消毒灭菌, 按照不同的处理将小麦植株的根、茎和叶片分开进行称量, 研磨成浆状, 进行梯度稀释, 分别在10^-1、10^-2和10^-3稀释液中吸取100 μ L涂布于添加抗生素的NA固体培养基上, 每个浓度涂3块平板作为重复。之后转移到37 ℃培养箱中培养, 24 h后对长出抗性菌落的单菌落数进行数量统计, 最后推算出单位质量小麦植株中的单菌落数。为检测小麦植株表面的消毒工作是否彻底, 需要取最后一次漂洗植株的无菌水液在NA固体培养基上涂布, 培养24 h, 观察是否有菌长出。

1.2.4 抗药菌株DZSG23^{Kan, Rif}在小麦穗部定殖量的检测

对小麦种子进行催芽, 24 h后选择露白情况一致的种子在温室花盆中播种并做好标记。每盆随机选择15粒播种, 当小麦植株进入扬花期时按照如下设计开展试验:

空白对照处理(CK1):随机选择长势一致的小麦植株, 用提前进行灭菌处理的NA液体培养液对准穗部喷洒并做好标记, 经过48 h套袋保湿处理后进行正常的肥水管理。

抗药菌株DZSG23^{Kan, Rif}处理(S1):将1× 10⁶ CFU· mL^-1左右的DZSG23^{Kan, Rif}培养液对准小麦的穗表面进行均匀喷施, 并做好标记, 经过48 h套袋保湿处理后进入正常的水肥管理。

穗部表面的菌落数检测:分别在菌液喷洒后的0、1、3、5、7、10、15、20、25、30 d随机选择3株长势一致的小麦植株, 在无菌接种台内用无菌水对小麦的穗部表面冲洗2次, 逐级进行梯度稀释, 在10^-2、10^-3稀释液中分别取100 μ L涂布在添加抗生素的NA固体培养基上, 2个浓度均涂3块平皿作为重复, 最终获得单位质量小麦穗表面抗性菌株定殖的单菌落数。

穗部内部菌落检测:对上述麦穗的表面进行消毒, 充分研磨成浆状, 梯度稀释, 从10^-2、10^-3稀释液中分别取100 μ L涂布在添加抗生素的NA固体培养基上, 每个浓度涂3块平皿作为重复, 最终获得单位质量小麦穗内部抗性菌株定殖的单菌落数。

1.2.5 拮抗菌株诱导小麦系统抗性的研究

试验设2个处理组, 分别为1× 10⁶ CFU· mL^-1左右的拮抗菌DZSG23、分生孢子浓度1× 10⁵ mL^-1左右的小麦赤霉病菌(标记为B)。当小麦进入到抽穗扬花期后按照试验的2个处理要求对准小麦穗部喷施, 并用无菌NA液体培养基对准小麦穗部喷洒作为对照处理。喷施后第0、12、24、36、48和72 h对各处理组的小麦穗部进行取样, 经过液氮快速冷冻后转移到-80 ℃冰箱中保存、备用。选择多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取各处理的麦穗RNA, 每个处理重复3次。PCR扩增引物序列见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实时荧光定量引物序列 Table 1 Primers used for quantitative polymerase chain reaction 基因 Gene 引物名称 Primer name 序列 Sequence ACOI ACOI-F 5'-TTTTGGACGGAGGGAGTACA-3' ACOI-R 5'-CCAGAGTCCCGAACAAGAGT-3' ERF ERF-F 5'-GCAAGGTGGTGATGGCAATG-3' ERF-R 5'-CGGCTCGACCCATCCAAATA-3' PR-1 PR-1-F 5'-AAGCTAGCTAGTGCAGGCAC-3' PR-1-R 5'-TTCTGCGCCTGGGAAAGATT-3' AOS AOS-F 5'-TCTTGTGCCCTTGTGTGTGT-3' AOS-R 5'-ATGGTGAGTGGCTGTGAATG-3' SAM SAM-F 5'-TCTCCGAGGCATCAATCTTT-3' SAM-R 5'-GCATGGTAGTCCCACAGGTC-3'

表1 实时荧光定量引物序列 Table 1 Primers used for quantitative polymerase chain reaction

数据分析方法采用DPS软件中的Duncan新复极差法等。

采用抗生素标记法获得1株双抗菌株DZSG23^{Kan, Rif}, 对此菌株开展了遗传稳定性试验。在含有抗生素和不含抗生素的2种NA固体培养基上, DZSG23^{Kan, Rif}菌株在生长数量上差异不明显, 长势上无明显变化。DZSG23^{Kan, Rif}菌株和原始菌株对禾谷镰孢的平板对峙试验结果见图1。原始菌株对禾谷镰孢的抑菌率为69.04%, DZSG23^{Kan, Rif}菌株的抑菌率为68.42%, 两者没有明显差别。由此可知, 突变菌株DZSG23^{Kan, Rif}抗性稳定, 可继续开展后续的定殖试验研究。

图1

Fig.1

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	图1 DZSG23原始菌株、突变菌株与禾谷镰孢的对峙培养Fig.1 Confrontation training of original strain, mutant strain of DZSG23 and F. graminearum

采用稀释涂布平板法研究芽孢杆菌DZSG23在小麦根际土壤的定殖情况, 结果如图2所示。

图2

Fig.2

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	图2 DZSG23Kan, Rif在小麦苗期的定殖动态 A, 根际土壤细菌数量; B, 小麦根部细菌数量; C, 小麦茎部细菌数量; D, 小麦叶部细菌数量。Fig.2 Colonization dynamics of Mutant strain DZSG23 at wheat seedling A, Number of bacterial in rhizosphere soil; B, Number of bacterial in the root of wheat; C, Number of bacterial in the stem of wheat; D, Number of bacterial in the leaf of wheat.

由试验结果可知, 添加灭菌NA液体培养基处理组和无菌水处理组(CK)相比, 根际土壤中的细菌数量无明显差别, 说明, NA液体培养基对苗期小麦根部的处理对小麦植株中的细菌数量变化无影响。抗药菌株DZSG23^{Kan, Rif}灌根处理苗期小麦根部, 其在小麦根际土壤中的动态变化如图2-A所示, DZSG23^{Kan, Rif}菌株的数量随着时间的推移出现先下降再上升的趋势, 当接种时间达到第27天时, 每g土壤中的DZSG23^{Kan, Rif}菌株数量最高, 达到5.76× 10⁶ CFU· g^-1后逐渐下降。究其原因可能是将DZSG23^{Kan, Rif}菌株接种至根际土壤后, 与根际微生物在空间位点和营养物质之间形成竞争以维持自身的生长繁殖, 刚开始菌株的数量出现下降的趋势, 当DZSG23^{Kan, Rif}菌株适应了根际土壤的环境并占据空间位点后, 菌株数量出现上升的趋势。

采用稀释涂布平板法研究小麦苗期DZSG23^{Kan, Rif}菌株的定殖情况, 将小麦苗分为根、茎、叶3个部分检测DZSG23^{Kan, Rif}菌株的定殖情况。在小麦根部(图2-B), 前期DZSG23^{Kan, Rif}菌株数量呈现缓慢增长的趋势; 随着DZSG23^{Kan, Rif}菌株在小麦体内移动, 根部的DZSG23^{Kan, Rif}菌株数量减少, 茎部的DZSG23^{Kan, Rif}菌株数量开始增多(图2-C), 并呈现缓慢增长的趋势; 随着时间推移, 茎部的DZSG23^{Kan, Rif}菌株向叶部移动, 叶部的DZSG23^{Kan, Rif}菌株数量开始增多(图2-D)。处理时间达到18 d后, DZSG23^{Kan, Rif}菌株适应了小麦体内的生长环境, 小麦根部、茎部和叶部的细菌数量均呈现上升趋势; 处理时间达到34 d时, 根部的DZSG23^{Kan, Rif}菌株达到1.437× 10⁶ CFU· g^-1, 茎部的DZSG23^{Kan, Rif}菌株达到3.285× 10³ CFU· g^-1, 叶部的DZSG23^{Kan, Rif}菌株达到2.377× 10³ CFU· g^-1。

采用稀释涂布平板法研究芽孢杆菌DZSG23在小麦穗部的定殖情况, 穗部定殖检测分为麦穗表面菌落数检测和麦穗内部菌落数检测。对麦穗表面的定殖检测结果如图3所示, 喷施DZSG23^{Kan, Rif}菌悬液后抗性菌株在麦穗表面的菌落数量呈先降低再上升的趋势。在接种抗性菌株第15天, 麦穗中DZSG23^{Kan, Rif}菌株的菌群密度达到最高, 为7.146× 10³ CFU· g^-1, 之后逐渐下降并趋于稳定。究其原因可能是将DZSG23^{Kan, Rif}菌株接种至麦穗表面后需要适应自然环境和穗部环境, 刚开始菌株的数量表现出下降的趋势; 当DZSG23^{Kan, Rif}菌株适应了麦穗表面环境和自然环境后, 菌株的数量表现出上升趋势。

图3

Fig.3

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	图3 DZSG23Kan, Rif在小麦穗表面的定殖动态Fig.3 Colonization dynamics of mutant strain DZSG23 on the surface of wheat ear

通过研究DZSG23^{Kan, Rif}菌株在穗内部的定殖情况发现, 在接种抗性菌株后的麦穗内部没有检测到DZSG23^{Kan, Rif}菌株, 可能是麦穗表面有坚硬的颖壳, DZSG23^{Kan, Rif}菌株无法穿透颖壳进入种子, 只能定殖于麦穗表面的颖壳上。

在前期拮抗菌株田间小区试验的基础上, 选取5个基因(PR-1、AOS、ACOI、ERF和SAM)开展拮抗菌株DZSG23诱导小麦植株抗病信号通路研究, 结果如图4所示。芽孢杆菌DZSG23处理小麦24 h后, PR-1基因的表达水平与对照相比上调了3.95倍, 随后PR-1的表达水平虽然逐步降低, 但依旧高于对照。与此同时, AOS基因的荧光定量结果显示, 经芽孢杆菌DZSG23处理的小麦植株, 接种后0 h开始, AOS的表达水平明显上调, 在第12 h达到最高, 为对照处理组的249.35倍。此外, 检测分析ACOI、ERF和SAM基因时, 发现拮抗菌处理组的上述3种基因表达水平均明显低于病原菌处理组。由上述结果可知, 将拮抗菌株DZSG23引入小麦穗部可以激活PR-1和AOS基因的表达, 诱导小麦中的水杨酸信号通路和茉莉酸信号通路。

图4

Fig.4

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	图4 不同处理下小麦植株诱导系统抗性的变化Fig.4 Induced system resistance changes of wheat plant under different treatments