猪粪样本采集于浙江省安吉县某猪场, 均匀混合后自然风干。供试菌株Z2、ZH14、AOZ、Y3、Y均为本实验室保藏菌株。

氨氮降解菌富集培养基(简称为富集培养基):硫酸铵 2.0 g、氯化钠0.3 g、七水硫酸亚铁0.03 g、磷酸氢二钾1.0 g、七水硫酸镁0.03 g、氯化钙7.5 g、蒸馏水1 000 mL, pH值7.2。121 ℃灭菌30 min。

LB培养基:酵母粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、蒸馏水1 000 mL, pH值7.0。121 ℃灭菌30 min。

YPD培养基:酵母粉10.0 g、蛋白胨20.0 g、葡萄糖20.0 g、蒸馏水1 000 mL, pH值7.0。115 ℃灭菌15 min。

MRS培养基:蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、七水硫酸镁 0.58 g、一水硫酸锰0.25 g、蒸馏水1 000 mL、吐温80 1 mL, pH值6.2~6.4。121 ℃灭菌30 min。

光合细菌培养基:氯化铵1.0 g、醋酸钠3.5 g、氯化镁0.1 g、磷酸二氢钾0.6 g、磷酸氢二钾0.4 g、酵母粉0.1 g、蒸馏水1 000 mL, pH值7.2。121 ℃灭菌30 min。

沙堡弱葡萄糖(SDA)培养基:蛋白胨10.0 g, 葡萄糖40.0 g、蒸馏水1 000 mL。115 ℃灭菌20 min。

孟加拉红培养基:蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、七水硫酸镁0.58 g、孟加拉红0.033 g、氯霉素0.1 g、蒸馏水1 000 mL。121 ℃灭菌20 min。

以上培养基无特殊说明时, 在使用时均系液体培养基。若为固体培养基时, 均须额外添加琼脂粉, 琼脂的质量浓度统一设定为20 g· L^-1。

氨气吸收液[c(H₂SO₄)=0.005 mol· L^-1]:量取2.8 mL浓硫酸加入水中, 并稀释至1 L, 临用时再稀释10倍^[7]。

酒石酸钾钠溶液(500 g· L^-1):称取50 g酒石酸钾钠(KNaC₄H₄O₆· 4H₂O)溶于100 mL水中, 煮沸, 使约减少20 mL为止, 冷却后, 再用水稀释至100 mL。

纳氏试剂:称取17 g二氯化汞(HgCl₂)溶于300 mL水中, 另称取35 g碘化钾(KI)溶解在100 mL水中, 然后将二氯化汞溶液缓慢加入到碘化钾溶液中, 直至形成红色沉淀不溶为止。再加入600 mL氢氧化钠溶液(200 g· L^-1)和剩余的二氯化汞溶液。将此溶液静置1~2 d, 使红色混浊物下沉, 将上清液移入棕色瓶中用橡皮塞塞紧, 保存备用。

氨标准贮备液:称取0.314 2 g经105 ℃干燥1 h的氯化铵(NH₄Cl), 用少量水溶解, 移入100 mL容量瓶中, 用氢气吸收液稀释至刻度。此溶液每1 mL含1.00 mg氨。

氨标准工作液:临用时, 将氨标准贮备液用氨气吸收液稀释至每1 mL含4.00 μ g氨。

1.4.1 氨氮降解菌株的富集驯化

取5 g风干猪粪接入到100 mL富集培养基, 30 ℃、220 r· min^-1摇床振荡培养, 检测到铵根离子消耗完毕后, 转接5 mL至新鲜的富集培养基中, 连续富集4次。

将猪粪缺氧自然发酵后, 刮取5 g带霉菌样品接入100 mL SDA培养基, 30 ℃、静置培养3~7 d, 观测到培养液浑浊、内含丝状体后, 转接5 mL培养液至新鲜的SDA培养基中, 连续转接4次。

1.4.2 氨氮降解菌株的分离纯化

将细菌富集液稀释涂布富集培养基固体平板, 在30 ℃恒温培养箱内培养3~5 d, 挑取特征不同的菌落分离纯化, 4 ℃冰箱保存备用。

取真菌富集液涂布于孟加拉红培养基固体平板上, 在30 ℃恒温培养箱内培养3~5 d, 挑取特征不同, 且菌落为非红色的丝状菌落划线分离, 4 ℃冰箱保存备用。

1.4.3 氨氮降解菌株的筛选

(1)初筛。取新鲜的猪粪200 g置于1 000 mL大烧杯中, 按0.1 mL· g^-1的接种量将重悬菌液接种于烧杯中, 用玻璃棒将培养液与猪粪混合均匀, 保鲜膜封口。对照组补加等量的无菌水。每组3个重复, 30 ℃静置培养7 d, 通过感官法^[8]初步判断菌株的氨氮降解效果。

(2)复筛。取初筛得到的菌株进行复筛试验。取新鲜的猪粪200 g置于1 000 mL大烧杯中, 按0.1 mL· g^-1的接种量将菌株接种于烧杯中, 用玻璃棒将菌液与猪粪混合均匀, 内置装有20 mL氨气吸收液的小烧杯, 保鲜膜封口。对照组补加等量的无菌水。每组3个重复, 每隔3 d取走小烧杯, 测量吸收液内含有的氨氮, 并更换新的吸收液。利用纳氏试剂检测法测定氨氮的释放量, 计算氨氮降解率, 确定氨氮降解率较高的菌株。

1.4.4 氨氮降解菌株的鉴定

将筛选得到的菌株划线到PDA培养基固体平板上, 30 ℃恒温培养48 h后, 进行形态学观察和生理生化鉴定。对于细菌菌株, 使用Hitachi H7650透射电子显微镜(日本日立)观察其亚显微结构; 对于真菌菌株, 使用MicroPublisher 5.0 RTV光学显微镜(美国QImaging)观察水浸片上的真菌细胞形态。挑取菌落加入装有PCR体系的PCR管中, 进行16S rRNA基因扩增。所用引物为原核生物16S rRNA PCR通用引物27F与1492R, 正向引物序列为5'-agagtttgatcctggctcag-3', 反向引物序列为5'-acggctaccttgttacgactt-3'。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR体系包括10× transtaq缓冲液5 μ L(含有15 mmol· L^-1的Mg²⁺)、dNTP(2.5 mmol· L^-1)4 μ L、上下游引物(10 μ mmol· L^-1)各0.8 μ L、DNA模板2 μ L(约30 ng)、Taq酶0.4 μ L, 用ddH₂O补至50 μ L。PCR程序:94 ℃预热4 min; 94 ℃变性1 min, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 31个循环; 72 ℃保持5 min, 4 ℃保存。扩增结果送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将所得结果在NCBI数据库上进行同源性比对分析, 并用MEGA程序构建系统进化树, 确定菌种。

1.4.5 氨氮降解菌株的拮抗试验

将优势菌株通过划线交叉法, 在YPD培养基固体平板上两两之间进行交叉划线, 观察交叉点是否有菌生长, 两者均可以生长则不拮抗, 1株或2株不能生长则为拮抗。

1.4.6 氨氮降解菌株的复配

取新鲜的猪粪200 g置于1 000 mL大烧杯中, 按0.1 mL· g^-1的接种量将重悬菌液接种于烧杯中, 用玻璃棒将培养液与猪粪混合均匀, 内置装有20 mL吸收液的小烧杯, 保鲜膜封口, 依前述试验结果选定菌株后, 除去相互拮抗关系, 将其相互组合, 对照组补加等量的无菌水, 每组3个重复, 每隔3 d取走小烧杯测量吸收液内含有的氨氮, 更换新的吸收液。

1.4.7 氨标准曲线与样品测定

取7支10 mL具塞比色管, 依次加入0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL的氨标准工作液, 使用无氨水定容至10 mL标线后, 在各管中按顺序加入0.2 mL酒石酸钾钠溶液和0.2 mL纳氏试剂, 混匀, 静置10 min。于波长420 nm处, 使用酶标仪测定吸光度。以吸光度(扣除空白组数据后)对氨浓度(mg· L^-1)绘制标准曲线。

样品测定时, 将10 mL样品原溶液或稀释至合适浓度的稀释溶液加入具塞比色管中, 使用制备标准曲线的操作步骤测定样品的吸光度。用10 mL吸收液作试剂空白进行测定。

应用SPSS 18.0软件对试验数据进行统计分析。

从安吉某猪场采集的粪污, 经过富集培养基的富集驯化后, 通过划线法分离菌株, 经多次纯化, 共分离得到13株可以降解氨氮的菌株, 将其中的细菌菌株分别命名为N1~N6, 真菌菌株分别命名为M1~M7。通过感官法初步测定各菌株对猪粪氨氮的降解效果, 结果如表1所示。根据感官筛选法, 具备一定氨氮降解能力的菌株为N2~N6和M1~M7。但是感官方法无法进一步明确菌株的氨氮去除效果, 因此, 选择上述菌株进行复筛。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 供试菌株的感官臭气评价 Table 1 Sensory evaluation of malodorous gas of test strains 菌株 Strain 感官评价 Sensory evaluation 无菌对照No strain +++++ N1 +++ N2 ++ N3 ++ N4 ++ N5 ++ N6 ++ M1 ++ M2 ++ M3 ++ M4 ++ M5 ++ M6 ++ M7 ++ ++, 能确定气味性质较弱的气味(识别阈值); +++, 很容易闻到, 有明显气味; +++++, 极强的气味。 ++, Weak smell which can be naturally identified (recognition threshold); +++, Distinct smell which can be easily smelt; +++++, Strong smell.

表1 供试菌株的感官臭气评价 Table 1 Sensory evaluation of malodorous gas of test strains

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 细菌菌株的生理生化特性 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of bacterial strains 测试指标Index Z2 Y AOZ 革兰氏染色Gram staining + + - 淀粉水解试验Starch hydrolysis test - - + 硝酸盐还原试验Nitrate reduction test - - + V-P试验V-P test + + - 产H2S试验H2S production test - - - 明胶液化试验Gelatin liquidized test + - - 接触酶Catalase + - + 氧化酶Oxidase + + - “ +” 表示测试结果为阳性; “ -” 表示测试结果为阴性。 “ +” indicated positive result; “ -” indicated negative result.

表2 细菌菌株的生理生化特性 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of bacterial strains

以不添加菌剂的组别作对照, 将初筛得到的菌株, 与实验室保藏的菌株Z2、ZH14、AOZ、Y3、Y进行复筛试验, 在实验室培养条件下测定各菌株对氨氮的去除效果, 计算不同时间各菌株对氨氮的降解率。细菌筛选结果见图1, 真菌筛选结果见图2。

图1

Fig.1

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	图1 不同细菌菌株在第3、6、9天的氨氮降解率Fig.1 Ammonia-nitrogen degradation rates of different bacteria strains on day 3, 6 and 9

图2

Fig.2

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	图2 不同真菌在第3, 6, 9天的氨氮降解率Fig.2 Ammonia-nitrogen degradation rates of different fungi strains on day 3, 6 and 9

由图1可以看出, 在复筛试验中, 筛选菌株降解氨氮的能力普遍低于实验室保藏菌株。整个试验过程中, 9 d时Z2菌株的氨氮降解率最高(47.43%)。此外, AOZ、Y菌株的氨氮降解效果亦较好, 最高氨氮降解率分别为43.28%和44.91%。

真菌复筛的结果如图2所示。M4菌株整体表现良好, 9 d时氨氮降解率最高(46.31%), 其余真菌菌株的氨氮降解率表现一般。

综上, 选取菌株Z2、AOZ、Y和M4作为复合氨氮降解菌剂的功能菌株, 进行后续复配试验。

对菌株M4、Z2、AOZ、Y进行菌落PCR, 扩增得到16S rDNA片段, 测序结果提交到GenBank数据库, 相应的登录号(accession number)分别为MT322238、MT322305、MT322306和MT322307。在NCBI数据库上进行BLAST序列比对, 通过MegaX构建系统发育树进行同源性分析, 结果如图3所示。结合菌落形态观察(图4)、细菌菌株的生理生化分析, 确定菌株Y为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei), Z2为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus), AOZ为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。真菌菌株M4具有尿素分解、尸胺分解和产脂的能力, 可利用葡萄糖与氨, 可基本确定M4为Dipodascus macroporus。将Z2菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC), 保藏号为M2018659。

图3

Fig.3

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	图3 基于16S rDNA的菌株Z2、AOZ、Y、M4系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain Z2, AOZ, Y and M4 based on 16S rDNA

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 菌株Z2、AOZ、Y、M4的形态 a、b、c依次为菌株AOZ、Y、Z2的电镜照片, d为M4的显微照片。Fig.4 Morphology of strains Z2, AOZ, Y and M4 a, b and c showed the transmission electron microscope photos of strain AOZ, Y and Z2, respectively; and d showed the micrograph of strain M4.

将得到的优势菌株Z2、AOZ、Y、M4进行拮抗试验。结果显示, 菌株M4与其他3株菌均有拮抗关系, 故其不参与复配。但要指出的是, 本研究中, 拮抗试验通过对峙培养法进行, 该法不能有效地控制菌株的生长量, 故而无法判断是营养竞争抑制还是其代谢物产生的拮抗作用。

将Z2、AOZ、Y按1∶ 1的比例进行复配, 形成4组(Z2+Y、Y+AOZ、Z2+AOZ、Z2+Y+AOZ), 进一步进行氨氮降解组合的筛选。以空白对照组的氨氮释放量为参照, 计算各个组合的氨氮降解率。如图5所示, 不同组合的氨氮降解率存在一定差异, 多菌组合对氨氮的去除效果一般, 组合Z2+Y对氨氮的去除效果最好, 9 d时氨氮降解率达到48.07%。

图5

Fig.5

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	图5 不同菌株组合在第3、6、9天的氨氮降解率Fig.5 Ammonia-nitrogen degradation rate of different bacterial combinations on day 3, 6 and 9

为检验复合菌剂Z2+Y对猪粪氨氮的降解效果, 设置不同的菌剂添加量(浓度梯度依次为0.01、0.03、0.05、0.10、0.15 mL· g^-1)进行氨氮降解试验, 结果如图6所示。可以看出, 各菌剂添加量下试验前期氨氮降解率均随着时间的延长而提高, 至第6天时氨氮降解率最高, 而后随着时间的延长降解率显著(P< 0.05)降低。当菌剂接种量为0.01~0.03 mL· g^-1时, 菌株对氨氮的降解率随着添加量的增大而增大, 当接种量为0.03~0.10 mL· g^-1时, 接种量的提升, 并未提高菌株对氨氮的降解率, 部分时间段存在降低的现象, 当接种量从0.10 mL· g^-1提升至0.15 mL· g^-1时, 菌株对氨氮的降解率显著(P< 0.05)降低。当菌株投加量为0.10 mL· g^-1时, 有部分时间段(3、6 d)除臭效果最优, 但综合全程除臭效果和成本考虑, 选择0.03 mL· g^-1为菌剂最佳接种量。

图6

Fig.6

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	图6 不同添加量的复合菌剂在第3、6、9天的氨氮降解率 同一时间点不同柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P< 0.05)。Fig.6 Ammonia-nitrogen degradation rate of different addition amount of bacterial combinations on day 3, 6 and 9 Bars marked without the same letters in the same time indicated significant difference within treatments at P< 0.05.