鲍蒸煮液, 由厦门岛之原生物科技有限公司提供。木糖、葡萄糖均为食品级, 无水乙醇、茚三酮等均为分析纯。

FE20型pH计(梅特勒托利多仪器有限公司); DU-30G型电热恒温油浴锅(上海恒科学仪器有限公司); 多功能卷式膜小试设备(厦门福美科技有限公司); 5804R型低温高速离心机(德国Eppendorf公司); XW-80A型旋涡混合仪(海门市其林贝尔有限公司); BS124S型分析天平(赛多利亚科学仪器(北京)有限公司); SP-756P型紫外可见分光光度计(上海光谱有限公司)。

1.3.1 鲍蒸煮浓缩液的制备

鲍蒸煮液经200 nm陶瓷膜除杂, 再经反渗透膜和截留分子量150 u的纳滤膜浓缩过滤, 获得2 800 mL可溶性固形物含量为10%的鲍蒸煮浓缩液。经测定, 鲍蒸煮液的蛋白质含量为4.50%, 多肽含量为0.35 mg· mL^-1, 游离氨基酸的含量为1.58 mg· mL^-1。

1.3.2 美拉德反应产物制备

取10 mL按1.3.1节制备的浓缩液于250 mL锥形瓶内, 按照一定比例添加葡萄糖、木糖, 混匀使糖充分溶解, 密封, 置于恒温油浴锅进行热反应。

1.3.3 美拉德反应条件的优化

单因素试验:糖配比的选择:取10 mL浓缩液, 分别加入不同比例的葡萄糖和木糖, 分成7组, 分别为(1)0 g; (2)1.0 g 葡萄糖(P)+0 g 木糖(M); (3)0.8 g P+0.2 g M; (4)0.6 g P+0.4 g M; (5)0.4 g P+0.6 g M; (6)0.2 g P+0.8 g M; (7)0 g P+1.0 g M; 于110 ℃反应30 min。反应温度的选择:选定温度为80, 90, 100, 110, 120, 130 ℃的体系环境进行美拉德反应, 研究温度对美拉德反应体系的影响。反应时间的选择:在110 ℃温度下设定反应时间分别为0, 15, 20, 25, 30, 60, 90, 120 min, 研究反应时间对美拉德反应的影响。糖浓度的选择:按照最适添加比例配制不同糖浓度的反应液, 测定反应产物中还原糖含量, 选出最适糖浓度。

响应面试验:根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理^[5], 以褐变程度、中间产物、游离氨基酸含量为响应值, 在单因素实验的基础上, 选取反应温度、反应时间、糖浓度进行响应面设计, 因子编码及各自变量水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验因素水平表 Table 1 Analytical factors and levels 因素 水平 -1 0 1 反应温度/℃ 105 110 115 反应时间/min 80 90 100 糖浓度/% 5 6 7

表1 试验因素水平表 Table 1 Analytical factors and levels

1.4.1 美拉德反应产物pH值的测定

待反应产物冷却至室温后, 用pH计直接测定反应产物的pH。

1.4.2 美拉德反应产物中间产物的测定

将美拉德反应产物稀释500倍, 在294 nm处测定吸光度^[6]。

1.4.3 美拉德反应产物褐变程度的测定

将美拉德反应产物稀释200倍, 在420 nm处测定吸光值^[7]。

1.4.4 游离氨基酸的测定

采用茚三酮比色法^[5]进行游离氨基酸的测定。用亮氨酸为标准品, 以亮氨酸浓度mg· mL^-1为x, 以D值为y, 绘制标准曲线, 得到回归方程:y=0.051 8x-0.004 8, R²=0.991 8。

1.4.5 还原糖的测定

测定采用3, 5-二硝基水杨酸比色法^[8]进行还原糖的测定。用葡萄糖标准液代替样品进行测定, 以每mg葡萄糖为x, 以D值为y, 绘制标准曲线, 得到回归方程:y=9.416 1x+0.011 2, R²=0.997 0。

反应率/%= 反应前还原糖含量-反应后还原糖含量反应前还原糖含量× 100

糖类对美拉德反应产物褐变程度影响大小为:五碳糖> 六碳糖> 双糖, 醛糖> 酮糖, 五碳糖中木糖反应性好、风味良好、价廉易得^[9]。六碳糖中葡萄糖属于醛糖, 美拉德反应速率较其他醛糖更快。其中木糖是产生呋喃类物质的良好前体物, 呋喃类物质具有甜味和焦糖香, 对产物香味有重要贡献^[10]。木糖和葡萄糖同时添加所得的产物中低分子量中间体的含量较单独添加一种还原糖高^[11]。

本试验选取不同比例的葡萄糖和木糖作为反应糖, 在110 ℃, 反应30 min, 结果见表2。由表2可知, 各体系的pH逐渐降低, 这是由于美拉德反应过程中产生了甲酸和乙酸等有机酸^{[12, 13]}, 使得体系的pH降低, pH值下降的程度是衡量美拉德反应剧烈程度的一个指标。褐色的类黑精是美拉德反应的重要产物, 褐变程度提供了一个可视化的测量手段, 各体系中D₄₂₀随木糖含量的增加总体呈升高的趋势, 在0 g P+1.0 g M组, D₄₂₀已升至0.387, 反应液的颜色太深, 不宜作为美拉德反应的糖配比。美拉德反应产物中的低分子量香味中间体可以用294 nm紫外吸收值表示, 吸收值越大, 香味物质越多, 由表2可知中间产物含量随木糖含量的升高总体呈现上升的趋势。游离氨基酸与糖或糖降解产物之间的反应对产物风味物质的形成具有重要的贡献^[14], 由表2我们可以看出氨基酸含量的变化趋势没有规律, 这是由于游离氨基酸含量主要取决于Strecker降解、氨基酸与糖的交联以及肽的降解反应^[15], 这3个反应可能是一个动态平衡, 随着糖比例的不同, 反应移动的方向不同。综合分析各个指标, 最终选取第5组作为美拉德反应的糖配比, 即糖配比为0.4 g P+0.6 g M(葡萄糖0.4 g+木糖0.6 g)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 糖配比设计方案与实验结果 Table 2 Experimental design and results in the treatments with different ratios of sugar 组号 反应后 pH D420值 D294值 游离氨基酸含量 /(mg· mL-1) 1 5.96 0.064 0.080 2.06 2 5.71 0.062 0.108 1.83 3 5.23 0.110 0.221 2.26 4 4.96 0.137 0.307 2.30 5 4.52 0.257 0.562 2.88 6 4.54 0.223 0.511 2.88 7 4.15 0.387 0.806 2.57

表2 糖配比设计方案与实验结果 Table 2 Experimental design and results in the treatments with different ratios of sugar

2.2.1 温度对热降解和美拉德反应规律的影响

取浓缩液10.0 mL, 糖加量1.0 g(葡萄糖:木糖=2:3)于恒温油浴锅内反应1 h, 对反应产物的pH、褐变程度、中间产物和游离氨基酸含量进行分析, 结果见图1。由图1可知, 美拉德反应组的温度越高, 反应产物pH越低, 中间产物、褐变程度越高, 说明温度越高, 美拉德反应进行得越完全; 热降解组因无美拉德反应进行, 产物pH、中间产物、褐变程度变化不明显; 其中游离氨基酸的含量为1.58~9.82 mg· mL^-1, 表明鲍蒸煮液经热降解可以释放出游离氨基酸, 由于热降解组无美拉德反应进行, 其游离氨基酸几乎无消耗, 所以热降解组比美拉德反应组的游离氨基酸含量更高。但考虑到实际操作中, 120, 130 ℃反应较难控制, 反应产物易出现焦糊味, 所以选取110 ℃作为最佳反应温度。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 反应温度对产物pH值、D420、D294和游离氨基酸含量的影响Fig.1 Effects of reaction temperature on pH value, D420, D294 and free amino acid content of the products

2.2.2 反应时间对热降解和美拉德反应规律的影响

取浓缩液10.0 mL, 糖加量1.0 g(葡萄糖:木糖=2:3)于110 ℃恒温油浴锅内反应, 对反应产物的pH、褐变程度、中间产物和游离氨基酸含量进行分析, 结果见图2。由图2可知, 随着反应时间的延长, 美拉德反应组产物的pH呈明显下降趋势, 褐变程度和中间产物含量呈现升高趋势; 热降解组由于没有发生美拉德反应, pH下降趋势不明显, 褐变程度和中间产物含量基本不变; 美拉德反应组和热降解组的游离氨基酸含量随着时间延长均呈现上升趋势, 说明持续的高温促进了样品中多肽类等水解成氨基酸, 而美拉德反应组由于美拉德反应消耗部分游离氨基酸, 所以其含量均低于热降解组的游离氨基酸含量。虽然随着时间的延长, 产物中游离氨基酸含量增高, 但是反应产物会有焦糊味, 这是在制备调味品时不期望的, 故选取最佳反应时间为90 min。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 反应时间对产物pH值、D420、D294和游离氨基酸含量的影响Fig.2 Effects of reaction time on pH value, D420, D294 and free amino acid content of the products

2.2.3 糖浓度对美拉德反应的影响

取浓缩液10 mL, 糖添加量按照比例(葡萄糖:木糖=2:3)梯度添加0~0.1 g· mL^-1, 于110 ℃恒温油浴锅内反应90 min, 结果如表3所示:随着糖浓度的增加, pH持续下降, 褐变程度、中间产物持续升高, 游离氨基酸先上升后下降, 说明开始时美拉德反应速率小于多肽、蛋白质类水解速率, 随后水解达到饱和, 美拉德反应速率增大, 产生更多风味物质, 所以氨基酸含量又呈现下降趋势。随着糖浓度的增加, 0~0.06 g· mL^-1时, 糖反应率呈升高趋势, 美拉德反应进程一直在增大; 0.06~0.10 g· mL^-1糖反应率呈下降趋势, 说明糖浓度高于0.06 g· mL^-1时糖反应率开始下降, 所以选取反应糖浓度为0.06 g· mL^-1。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 糖浓度对美拉德反应的影响 Table 3 Effect of sugar concentrations on Maillard reaction 糖浓度/(g· mL-1) 反应后pH D420值 D294值 游离氨基酸含量/(mg· mL-1) 糖反应率/% 0 6.93 0.027 0.040 2.11 0 0.02 5.32 0.061 0.144 2.42 91.0 0.04 5.01 0.080 0.179 2.56 93.2 0.06 4.81 0.088 0.243 2.34 95.3 0.08 4.67 0.104 0.253 2.12 93.6 0.10 4.47 0.131 0.323 2.03 91.0

表3 糖浓度对美拉德反应的影响 Table 3 Effect of sugar concentrations on Maillard reaction

2.2.4 响应面优化试验

响应面法克服了正交设计只能处理离散水平值, 无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应最优值的缺陷。响应面分析方法是研究几种因素间交互作用的回归分析方法。在单因素试验的基础上, 以反应时间(A)、反应温度(B)、糖浓度(C)为自变量, 以D₄₂₀值、D₂₉₄值、游离氨基酸含量为响应值, 通过三因素三水平的响应面分析方法, 优化鲍蒸煮液美拉德反应的工艺条件, 试验设计方案及结果见表4。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 响应面设计方案与实验结果 Table 4 Design and results of the response surface method 实验号 A反应温度/℃ B反应时间/min C 糖浓度/% D420值 D294值 游离氨基酸含量/(mg· mL-1) 1 110 80 5 0.233 0.297 1.66 2 110 90 6 0.208 0.255 1.63 3 105 100 6 0.158 0.175 1.93 4 110 100 7 0.631 0.714 2.66 5 110 90 6 0.215 0.260 1.65 6 115 100 6 0.801 0.812 3.89 7 110 90 6 0.233 0.292 1.61 8 115 90 5 0.615 0.719 4.09 9 115 90 7 0.628 0.731 3.45 10 105 90 7 0.117 0.154 1.43 11 105 90 5 0.131 0.159 1.92 12 110 90 6 0.207 0.250 1.60 13 110 90 6 0.231 0.286 1.69 14 105 80 6 0.118 0.143 1.31 15 110 100 5 0.606 0.691 2.60 16 115 80 6 0.534 0.594 3.44 17 110 80 7 0.533 0.703 3.28

表4 响应面设计方案与实验结果 Table 4 Design and results of the response surface method

将表4所得的试验数据采用Design Expert8.0.6软件进行分析, 得到以反应产物的Y₁(D₄₂₀)为目标函数的二次回归方程:

Y₁=447.41902-7.85548A-2.33698B-40.40620C+0.037215AB+0.71855AC-6.87500× 10^-3BC+0.035439A²+1.55975× 10^-3B²+0.12598C²-1.64000× 10^-4A²B-3.26000× 10^-3A²C

由表5可知, 此方程的P< 0.000 1, 所建立的回归模型达到极显著水平; 而该模型的失拟项不显著, R²=0.998 7, RAdj2=0.995 7, 表明该模型拟合程度良好, 说明响应值的变化有99.57%来源于所选变量, 可用此方程来分析和预测鲍蒸煮液美拉德反应的褐变程度。其中项A, B, C, AB, BC, A², B², C², A²B, A²C对响应值的影响显著, 二次项AC对响应值的影响不显著。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 D420显著性检验 Table 5 Significance test for the established regression model for D420 项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 0.85 11 0.077 341.59 < 0.0001 * * A-温度 0.53 1 0.53 2327.70 < 0.0001 * * B-时间 0.055 1 0.055 244.79 < 0.0001 * * C-糖浓度 0.026 1 0.026 116.55 0.0001 * * AB 0.013 1 0.013 56.86 0.0006 * * AC 1.822× 10-4 1 1.822× 10-4 0.80 0.4109 BC 0.019 1 0.019 83.45 0.0003 * * A2 3.295× 10-3 1 3.295× 10-3 14.54 0.0125 * B2 0.10 1 0.010 452.13 < 0.0001 * * C2 0.067 1 0.067 294.93 < 0.0001 * * A2B 3.362× 10-3 1 3.362× 10-3 14.84 0.0120 * A2C 0.013 1 0.013 58.64 0.0006 * * 残差 1.133× 10-3 5 2.266× 10-4 失拟项 5.120× 10-4 1 5.120× 10-4 3.30 0.1435 注:P值是方差齐次性检验的结果; * * 表示极显著水平(P< 0.01); * 表示显著水平(0.01< P< 0.05)。

表5 D420显著性检验 Table 5 Significance test for the established regression model for D420

由表4的试验结果得到以反应产物的Y₂(D₂₉₄)为目标函数的二次回归方程:

Y₂=492.06005-8.68093A-2.20083B-52.24090C+0.035030AB+0.92925AC-9.57500× 10^-3BC+0.039308A²+1.61450× 10^-3B²+0.17120C²-1.55000× 10^-4A²B-4.2200× 10^-3A²C

由表6可知, 此方程的P< 0.000 1, 所建立的回归模型达到极显著水平; 而该模型的失拟项不显著, R²=0.998 3, RAdj2=0.994 5, 表明该模型拟合程度良好, 说明响应值的变化有99.45%来源于所选变量, 可用此方程来分析和预测鲍蒸煮液美拉德反应中间产物的变化情况。其中项A, B, C, AB, BC, C², A²B, A²C对响应值的影响显著, 二次项A², B², AC对响应值的影响不显著。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 D294显著性检验 Table 6 Significance test for the established regression model for D294 项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 1.01 11 0.092 262.72 < 0.0001 * * A-温度 0.62 1 0.62 1762.72 < 0.0001 * * B-时间 0.041 1 0.041 116.81 0.0001 * * C-糖浓度 0.046 1 0.046 131.06 < 0.0001 * * AB 8.649× 10-3 1 8.649× 10-3 24.64 0.0042 * * AC 7.225× 10-5 1 7.225× 10-5 0.21 0.6691 BC 0.037 1 0.037 104.46 0.0002 * * A2 3.800× 10-6 1 3.800× 10-6 0.011 0.9212 B2 0.11 1 0.11 312.63 < 0.0001 * * C2 0.12 1 0.12 351.53 < 0.0001 * * A2B 3.003× 10-3 1 3.003× 10-3 8.55 0.0328 * A2C 0.022 1 0.022 63.41 0.0005 * * 残差 1.755× 10-3 5 3.511× 10-4 失拟项 3.001× 10-4 1 3.001× 10-4 0.82 0.4151

表6 D294显著性检验 Table 6 Significance test for the established regression model for D294

由表4的数据得到以Y₃ (游离氨基酸含量)为目标函数的二次回归方程:

Y₃=1501.4980-27.1011A+8.6599B-341.2190C-0.16585AB+6.17450AC-0.03900BC+0.12468A²+4.1700× 10^-3B²+0.49700C²+7.5000× 10^-4A²B-0.02810A²C

由表7可知, 此方程的P< 0.000 1, 所建立的回归模型达到极显著水平; 而该模型的失拟项不显著, R²=0.999 5, RAdj2=0.998 6, 表明该模型拟合程度良好, 说明响应值的变化有99.86%来源于所选变量, 可用此方程来分析和预测鲍蒸煮液美拉德反应的游离氨基酸的变化情况。其中项A, B, C, BC, A², B², C², A²B, A²C对响应值的影响显著, 二次项AB, AC对响应值的影响不显著。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 游离氨基酸显著性检验 Table 7 Significance test for the established regression model for free amino acid content 项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 14.13 11 1.28 1008.51 < 0.0001 * * A-温度 8.57 1 8.57 6726.69 < 0.0001 * * B-时间 0.026 1 0.026 20.09 0.0065 * * C-糖浓度 0.71 1 0.71 553.85 < 0.0001 * * AB 7.225× 10-3 1 7.225× 10-3 5.67 0.0631 AC 5.628× 10-3 1 5.628× 10-3 4.42 0.0896 BC 0.61 1 0.61 477.55 < 0.0001 * * A2 1.46 1 1.46 1148.51 < 0.0001 * * B2 0.73 1 0.73 574.70 < 0.0001 * * C2 1.04 1 1.04 816.36 < 0.0001 * * A2B 0.070 1 0.070 55.19 0.0007 * * A2C 0.99 1 0.99 774.74 < 0.0001 * * 残差 6.370× 10-3 5 1.274× 10-3 失拟项 1.250× 10-3 1 1.250× 10-3 0.98 0.3790

表7 游离氨基酸显著性检验 Table 7 Significance test for the established regression model for free amino acid content

2.2.5 最优工艺条件的确定及结果验证

通过数学模型优化美拉德反应工艺, 得到最优工艺条件为反应温度为115 ℃、反应时间84.14 min、糖浓度5.00%时, 预测的响应值分别为:D₄₂₀=0.558、D₂₉₄=0.648、游离氨基酸含量3.860 mg· mL^-1。考虑到实际操作的便利, 将最佳工艺条件修正为:反应温度为115 ℃、反应时间84 min、糖浓度5%, 为了检验模型预测的准确性, 采用响应面优化工艺条件进行验证试验, 所测得的美拉德反应检测指标为D₄₂₀=0.552、D₂₉₄=0.653、游离氨基酸含量3.930 mg· mL^-1, 实际实验值与模型预测值基本一致, 可见该模型能较好地预测美拉德反应。