供试土壤样品取自山东省德州市农业科学院, 试验在同一地区相邻地块共设9个小区, 进行连作3年辣椒、玉米-辣椒间作3年、大蒜-辣椒轮作3年3个处理, 每个处理各随机占3个小区, 小区之间由挑沟进行分隔, 供试辣椒品种为德红2号。在进行该试验之前, 各处理土壤化学特征相似:土壤pH值为7.96± 0.05, EC值为(773± 11)μ S· cm^-1, 有机质含量为(11.712± 0.857)g· kg^-1。试验地区50%以上为潮土类, 碱解氮含量属中等水平, 速效磷含量较高, 速效钾含量一般, 当地农民常规栽培管理。土壤样品的采集于2017年8月末辣椒成熟期进行。在每个处理小区按五点取样法随机取样, 即选择长势均匀并具有代表性的5株辣椒, 用直径约5 cm的土钻取距辣椒植株约5 cm处、0~20 cm深的根际土样作为一个样品, 混匀并挑除杂质放入取样袋带回实验室。之后一部分于4 ℃冰箱内冷藏用于稀释平板法测可培养微生物数量; 一部分置于阴凉处风干, 过2 mm筛用于土壤酶活性的测定; 另一部分样品装在灭过菌的50 mL离心管内置于-80 ℃超低温冰箱内冷冻保存, 用于高通量测序分析微生物群落结构。

1.2.1 土壤微生物数量测定

采用稀释平板计数法进行微生物检测^[11], 细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养, 选择10^-4、10^-5、10^-6倍稀释度悬液涂平板, 每个稀释度均做3个重复, 在37 ℃条件下倒置培养2 d后计数; 真菌培养采用孟加拉红培养基, 选择10^-1、10^-2和10^-3倍稀释度悬液涂平板, 每个稀释度做3个重复, 在28 ℃条件下倒置培养3~5 d后计数; 放线菌培养采用改良高氏一号培养基, 选择10^-3、10^-4和10^-5倍稀释度悬液涂平板, 每个稀释度做3个重复, 在30 ℃条件下倒置培养5~7 d后计数, 并计算土壤中细菌和真菌数量的比值(B/F), 以反映土壤微生物区系结构; B/F比值降低, 导致土壤土传病害发生严重^{[12, 13]}。

1.2.2 土壤酶活性的测定

土壤过氧化氢酶和土壤脲酶活性分别采用Solarbio公司土壤过氧化氢(S-CAT)检测试剂盒和Solarbio公司土壤脲酶(S-UE)检测试剂盒测定。

1.2.3 土壤微生物高通量测序

土壤微生物分析采用新一代高通量测序技术(high-throughput sequencing), 这一技术又称二代测序(next generation sequencing, NGS)或者平行测序(parallel sequencing), 可直接测序16S rRNA基因的PCR产物, 每次分析获得的基因序列数以百万甚至亿万计, 不仅通量高, 而且能够同时分析上百个不同的样品, 是解析复杂环境中微生物群落物种组成和相对丰度的重要工具, 已经成为环境微生物多样性检测的首选^{[14, 15]}。Shannon-winner曲线是利用Shannon指数来进行绘制的, 反映样品中微生物多样性的指数, 利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线, 以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。

土壤微生物DNA提取采用E.Z.N.A. ® Soil DNA Kit试剂盒, 分别用真菌和细菌通用引物进行PCR扩增, 引物具体信息如表1所示, 对扩增产物切胶回收检测浓度后保存于-20 ℃用于后续的高通量测序。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 PCR扩增产物 Table 1 Primers used for PCR amplification 目的序列Target sequence 引物序列Primer sequence(5'-3') 片段长度Fragment size/bp 细菌16S V3-V4 Bacterial 16S V3-V4 GTGCCAGCMGCCGCGG 392 CCGTCAATTCMTTTRAGTTT 真菌28S Fungal 28S GTGCCAGCMGCCGCGG 345 CCTCCGCTTATTGATATGC

表1 PCR扩增产物 Table 1 Primers used for PCR amplification

如表2所示, 测试土壤中微生物群落中可培养的细菌数量最多, 其次是放线菌, 真菌数量最少, 而且不同种植模式对土壤三大类群微生物数量有显著的影响。不同种植模式土壤细菌数量变化为间作> 轮作> 连作; 土壤真菌数量变化为连作> 间作> 轮作; 土壤放线菌数量变化为轮作> 间作> 连作。与连作辣椒模式相比, 大蒜-辣椒轮作以及玉米-辣椒间作能够明显增加土壤细菌数量, 增幅分别为88.24%、112.61%; 土壤放线菌数量分别增加302.81%、156.25%; 土壤真菌数量分别减少51.74%、39.57%, 差异达到显著(P< 0.05)水平。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同种植模式土壤三大类群微生物数量变化 Table 2 Dynamic of three major microbial number of different planting patterns 处理 Treatment 细菌数 Bacterium (106 g-1) 真菌数 Fungi (103 g-1) 放线菌数 Actinomycetes (104 g-1) B/F 间作Intercropping 2.53± 0.47 a 1.39± 0.15 b 8.20± 3.2 ab 1.83± 0.24 ab 轮作Rotation 2.24± 0.24 a 1.11± 0.55 b 12.89± 2.1 a 2.02± 1.00 a 连作Continuous cropping 1.19± 0.25 b 2.30± 0.13 a 3.2± 0.4 b 0.52± 0.14 b The values in the same column followed by different letters showed significant difference (P< 0.05). The same as below. 同列数据后没有相同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。下同。

表2 不同种植模式土壤三大类群微生物数量变化 Table 2 Dynamic of three major microbial number of different planting patterns

此外, 大蒜-辣椒轮作土壤中细菌和真菌数量的比值(B/F)最大, 玉米-辣椒间作土壤次之, 连作辣椒土壤最小, 说明轮作和间作处理均能促进土壤细菌增殖而抑制真菌增殖, B/F值升高。以上结果表明, 采用大蒜轮作和玉米间作能够有效改善辣椒根际微生物区系, 使根际微生物组成由真菌型向细菌型转变。

2.2.1 轮间作处理对连作辣椒根际土壤微生物多样性的影响

从表3的微生物多样性Shannon指数中可以看出, 各处理土壤细菌和真菌Shannon指数差异达到显著水平(P< 0.05)。与连作土壤相比, 轮作和间作处理能够显著增加土壤细菌群落Shannon指数, 增幅分别为6.84%、5.63%; 同时分别显著降低土壤真菌群落Shannon指数, 降幅分别为13.06%、5.23%。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同处理土壤细菌和真菌Shannon指数 Table 3 Shannon index of soil bacteria and fungi of different treatments 处理 Treatment 群落多样性(Shannon指数) Shannon index 细菌Bacteria 真菌Fungi 间作Intercropping 12.296± 0.057 b 7.044± 0.011 b 轮作Rotation 12.437± 0.058 a 6.462± 0.012 c 连作Continuous cropping 11.641± 0.050 c 7.433± 0.008 a

表3 不同处理土壤细菌和真菌Shannon指数 Table 3 Shannon index of soil bacteria and fungi of different treatments

2.2.2 轮间作处理对辣椒根际连作土壤微生物群落组成的影响

如图1所示, 所有样品中相对丰度大于1%的细菌按照其相对丰度的高低依次为(α -, β -, γ -, δ -)变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidete)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes), 其中(α -, β -, γ -, δ -)变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)为优势种群, 所有样品中它们相对丰度分别为32%、23%; 此外, 所有样品中真菌相对丰度从高到低依次为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota), 其中子囊菌门(Ascomycota)为优势种群, 占所有可测真菌群落的59%, 是供试土壤样品中主要的真菌类群。

图1

Fig.1

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	图1 细菌(A)和真菌(B)分类群组成 由每个分类群条带总数占测序条带总数的比例绘制而成。Fig.1 Bacteria (A) and fungi (B) taxonomic group The figure was drawn according to the percentage of number of each taxon bands in the total number of sequencing bands.

如图2-A所示, 不同处理土壤细菌群落中酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidete)、浮霉菌门(Planctomycetes)、黄单孢菌目(Xanthomonada)相对丰度差异较大。与连作3年相比, 轮作和间作处理显著提高了土壤酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度, 增幅为27.91%、39.42%; 同时提高了浮霉菌门(Planctomycetes)的相对丰度, 增幅为61.22%、51.63%; 但显著降低了拟杆菌门(Bacteroidete)和黄单孢菌目(Xanthomonada)的相对丰度, 以轮作处理效果最为显著, 降幅分别为71.78%、47.86%。图2-B是不同处理土壤中相对丰度差异显著(P< 0.05)的三类真菌, 虽然子囊菌门座囊菌纲(Dothideomycetes)和接合菌门(Zygomycota)相对丰度较低, 但在不同处理土壤中相对丰度差异显著。与连作3年土壤相比, 轮间作处理显著降低了子囊菌门座囊菌纲(Dothideomycetes)和镰刀菌属(Fusarium)的丰度, 其中子囊菌门座囊菌纲(Dothideomycetes)的相对丰度分别减少56.36%、81.81%, 镰刀菌属(Fusarium)的相对丰度分别减少46.77%、36.62%, 但接合菌门(Zygomycota)相对丰度显著增多, 分别增加433.33%、283.33%。

图2

Fig.2

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	图2 不同处理土壤细菌和真菌相对丰度差异 同一种类不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。Fig.2 Differences between soil bacteria and fungi abundance of different treatments The bars in the same type with different letters showed significant difference(P< 0.05).

如图3所示, 与连作土壤相比, 玉米-辣椒间作和大蒜-辣椒轮作明显增加了土壤过氧化氢酶活性, 增幅分别为109.92%、122.31%, 此外, 轮间作处理也显著提高了土壤脲酶活性, 增幅分别为129.34%、93.67%, 以轮作效果更为明显, 差异达到显著(P< 0.05)水平。

图3

Fig.3

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	图3 不同处理土壤过氧化氢酶和脲酶活性 不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。Fig.3 Soil catalase and urease activity of different treatments The bars with different letters showed significant difference(P< 0.05).