摘要: 采用易错PCR方法对枯草芽孢杆菌脂肪酶基因lipaseA进行定向进化,并首次采用对硝基苯棕榈酸酯(pNPP)法进行96孔板高通量筛选。结果表明:第一轮易错PCR没有产生随机突变,第二轮易错PCR反应在Mn2+浓度为0.2 mmol·L-1时,产生了突变菌株。对该条件下构建的文库中124株突变菌株进行pNPP高通量筛选,突变株4B2的吸光度值A405为1.395,与未突变株PET32alipaseA(A405=0.448)差异显著。测序结果表明,突变株4B2脂肪酶基因lipaseA有5个核苷酸位点发生了突变,其中3个是同义突变,2个是错义突变,分别是82位的天冬酰胺(AAU)突变为酪氨酸(UAU),143位的赖氨酸(AAG)突变为苏氨酸(ACG)。突变株4B2发酵上清液转化生物柴油的转酯效率较对照菌PET 32alipaseA有明显提高,前者为79.5%,后者为49.72%。本研究为枯草芽孢杆菌脂肪酶lipaseA转酯活性位点的探索奠定了基础。